超声波辅助提取虫草参多糖及其抗氧化能力研究

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1.1 试材

虫草参（中国剑川县车记地参食品厂），烘干粉碎过60目筛备用。葡萄糖等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器

数显恒温水浴锅（HH-4型，常州国华电器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-9600型，北京北分瑞利分析仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（RE-52型，上海亚荣生化仪器）；循环水式真空泵[SHZ-D（Ш）型，巩义市予华仪器有限责任公司]；植物粉碎机（LG-500A型，瑞安百信药机械厂）；低速自动平衡离心机（DT5-4B型，北京时代北利离心机有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制。

精确称取葡萄糖标品10 mg，溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准溶液，蒸馏水补齐至2.0 mL，加入1 mL 6%苯酚溶液及5 mL 98%硫酸，摇匀，30 ℃水浴20 min，于490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

1.3.2 虫草参多糖提取工艺。

称取一定量虫草参粉末，采用超聲波辅助提取虫草参多糖，所得样品离心后，取上清液定容，依照苯酚硫酸法测定其多糖含量。分别考察超声功率、提取时间、液料比对虫草参多糖提取率的影响。并在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验（表1），得出最佳工艺条件。

1.3.3 清除羟基自由基能力测定[8-12]。

取2支25 mL比色管，加入5 mL 2 mmol/L FeSO4、5 mL 6 mmol/L H2O2，混合均勻后用6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液补齐至刻度，于510 nm处立即测定吸光度A0，再加入1 mL虫草参多糖溶液，摇匀后测定吸光度Ax，并按公式（1）计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率=（A0-Ax）/A0×100%（1）

式中，Ax为虫草参多糖组吸光度，A0为空白组吸光度。

1.3.4 清除超氧阴离子自由基能力测定[8-12]。

取2支25 mL比色管，加入4.5 mL 0.05 mol/L pH为8.2的Tris-HCl溶液，于25 ℃水浴20 min后，加入0.5 mL 0.025 mol/L邻苯三酚溶液及1 mL虫草参多糖溶液，混匀后放置5 min，再加入1 mL 8 mol/L的HCl，摇匀后于320 nm处测定吸光度，并按公式（2）计算超氧阴离子自由基清除率。

超氧阴离子自由基清除率=（A0-Ax）/ A0×100%（2）

式中，Ax为虫草参多糖组吸光度，A0为空白组吸光度。

1.3.5 清除DPPH·自由基能力测定[8-12]。

取20 mg DPPH·用无水乙醇溶解并定容至500 mL，取1 mL虫草参多糖样品与1 mL DPPH·混合反应30 min后，于517 nm处测定吸光度Ax，并按照公式（3）计算DPPH·自由基清除率。

DPPH·自由基清除率=（Ax-A1）/A2×100%（3）

式中，Ax为虫草参多糖组与DPPH·反应的吸光度，A1为虫草参多糖组与溶剂的吸光度，A2为DPPH·与溶剂的吸光度。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

由图1可知，葡萄糖标准曲线的线性回归方程为y=6.020 6x+0.007 1（R2=0.999 1），表明葡萄糖含量在0～0.14 mg线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声功率对虫草参多糖提取率的影响。

从图2可看出，随着超声功率的增大，虫草参多糖提取率不断提高，当超声功率达到400 W时，提取率为36.31%，随着超声功率继续增大，多糖溶出率上升趋势减缓。可能是因为在较低超声功率情况下，超声波能逐渐破坏细胞壁，致使内容物溶出，而随着超声功率的提高，在一定时间内虫草参细胞能被基本破坏，内容物已充分溶出，所以多糖溶出率上升趋势减缓，故选择超声功率为400 W为宜。

2.2.2 提取时间对虫草参多糖提取率的影响。

由图3可知，随着提取时间的延长，虫草参多糖提取率不断提高，当提取时间达到40 min时，提取率为42.59%，随着提取时间继续延长，多糖溶出率上升趋势减缓。可能是因为在较短的提取时间内，超声波快速破坏细胞壁，使细胞内容物释放，随着时间的延长，细胞壁已经被完全破坏，内容物已充分溶解，使得多糖溶出率升高趋势变缓，因此，超声提取时间确定为40 min。

2.2.3 液料比对虫草参多糖提取率的影响。

从图4可看出，随着液料比的增大，虫草参多糖提取率不断提高，当液料比达到30∶1时，提取率为56.24%，随着液料比继续增大，多糖溶出率上升趋势减缓。可能是因为在一定质量虫草参粉末情况下，随着溶剂用量的增加，增大了虫草参与溶剂接触面的浓度差，从而提高了多糖传质速率，随着溶剂用量继续增加，内容物已完全溶出，使得多糖溶出率升高趋势变缓，因此，液料比确定为30∶1。

2.3 正交试验

由表2可知，超声波辅助提取虫草参多糖最佳工艺为A3B2C3，即超声功率为500 W，提取时间为40 min，液料比为40∶1，在此条件下多糖提取率为62.65%，经此条件验证，虫草参多糖提取率为60.94%。通过极差分析可知，各影响因素主次顺序依次为超声功率、液料比、提取时间。

2.4 清除羟基自由基能力测定

由图5可知，随着虫草参多糖浓度的增加，其清除羟基自由基能力不断提高，当多糖浓度为40 μg/mL时，其清除率达80.33%，同等浓度下的维生素C溶液清除率为68.67%，虫草参多糖对羟基自由基清除能力明显优于维生素C溶液。

2.5 清除超氧阴离子自由基能力测定

从图6可看出，随着虫草参多糖浓度的增加，其清除超氧阴离子自由基能力不断提高，当多糖浓度为50 μg/mL时，清除率达52.33%，同等浓度下的维生素C溶液清除率为47.67%，虫草参多糖对超氧阴离子自由基清除能力明显优于维生素C溶液。

2.6 清除DPPH·自由基能力测定

由图7可知，随着虫草参多糖浓度的增加，其清除DPPH·自由基能力不断提高，当多糖濃度为50 μg/mL时，清除率达50.33%，同等浓度下的维生素C溶液清除率为44.67%，虫草参多糖对DPPH·自由基清除能力明显优于维生素C溶液。

3 小结

围绕虫草参多糖提取工艺进行研究，并考察其抗氧化能力，在单因素试验的基础上进行正交试验，得出虫草参多糖最佳提取工艺为A3B2C3，即超声功率500 W、提取时间40 min、液料比40∶1，在此条件下多糖提取率为62.65%，经此条件验证，虫草参多糖提取率为60.94%；各影响因素主次顺序依次为超声功率、液料比、提取时间。所得虫草参多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基均有一定的清除作用，在一定的范围内，多糖浓度越高，抗氧化效果越好，且虫草参多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基清除能力明显优于维生素C溶液。由此可知，虫草参多糖具有一定的抗氧化作用，能延缓自由基对人体细胞的损伤。

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