摘要：指出了超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，作为超氧阴离子自由基的专一清除剂，在疾病的治疗、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用。以大豆为实验材料，对其中的SOD酶提取流程进行了优化，然后利用改良的邻苯三酚自氧化法测定了所提取的SOD酶的活性，建立了最适合大豆的SOD酶提取流程。最后对九个不同产地大豆SOD酶活性进行了比较，结果显示：来自黑龙江的大豆酶活力最高，适合大规模生产。
关键词：超氧化物歧化酶；改良的邻苯三酚自氧化法；大豆
中图分类号：Q554.6
文献标识码：A文章编号：16749944（2017）8023204
1引言
SOD是生物体内一种非常重要的金属酶，广泛存在于各种生物体中。同时也是一种重要的抗氧化剂，它的作用底物是超氧阴离子·O2-，催化超氧阴离子发生歧化反应，从而清除·O2-自由基[1，2]。目前SOD已在多个领域中被应用，比如医疗保健[3]、食品工业[4]、以及植物抗逆[5]等。植物来源SOD的分离纯化[6～8]主要工艺流程为：植物-精制-超滤浓缩-冷冻干燥-产品。SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法[9-11]。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶法、细胞色素法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。邻苯三酚自氧化法的主要原理为：在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生·O2，在SOD存在下，自氧化反应受到抑制。该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、pH值、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时要严格控制这些因素[12～14]。
笔者提取了大豆中的SOD酶，然后利用改良的邻苯三酚自氧化法对大豆的SOD酶活性进行了测定，对测定过程中的各个条件进行了探索，建立了大豆SOD酶测定最佳方法，并对不同产地大豆的SOD活性进行了比较，使SOD在规模化生产的同时更具针对性。
2材料与方法
2.1材料和仪器
本实验所使用的大豆样品来源于9个产地，分别为：广东（广州）、北京、江苏（动台）、黑龙江（佳木斯）、黑龙江（牡丹江）、福建（厦门）、广西（柳州）、湖北（武汉）、湖南（长沙）。对应的编号分别为1～9。
实验材料：Tris base（国药集团化学试剂有限公司，优级纯）；其余试剂均为分析纯。A液：称取1.2114 g Tris和37.2 mg EDTA·2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。
实验仪器：紫外可见分光光度计（UEG1008016，上海美谱达仪器有限公司）；微型酸度计（PHSJ-3F，上海精科）；高速离心机（TGL-20M，长沙平凡仪器仪表有限公司）；超纯水系统（Aquaplore3S，颐洋企业发展有限公司）。
2.2SOD酶提取与处理
2.2.1粗酶液的提取
将大豆种子洗净淋干，于pH值为7.8的PBS缓冲液中浸泡10 h。清洗后加入4℃三倍体积的预冷缓冲液，在冰上匀浆。匀浆后加入一定量的缓冲液，在超声波清洗机中超声，使细胞破碎，得到粗酶液。
2.2.2SOD粗酶液的处理
热变性：分别取一定体积的粗酶液，放入60℃的水浴锅中分别保温10、15、20 min，在5000 r/min、4℃的离心条件下离心15 min去除沉淀，测定上清液中酶活力及蛋白含量，筛选热变性的最佳时间。
丙酮沉淀：取一定体积的酶液，置于冰浴中，缓慢加入-20℃预冷的丙酮，搅拌10 min，4℃下静置5 h，待其自然沉淀后， 4℃、5000 r/min离心15 min弃去上清液，收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，4℃、5000 r/min离心15 min后测定上清液酶活力和蛋白含量。
2.3酶活性与浓度的测定
2.3.1酶活力的测定
邻苯三酚自氧化速率测定严格控制在25℃进行。于15 mL比色管中用微量移液器依次加入A液2.35 mL，蒸馏水2.015 mL，B液0.35 mL。加入B液后立即混合并倾入比色皿，于325 nm处测吸光值，共测4次，即取开始后30s和90s时的吸光值，二者之差即为邻苯三酚自氧化速率△A325。本试验确定△A325值为0.060。测定样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率时样品的加入顺序如表1所示，分别加入一定量样液或酶液使邻苯三酚自氧化速率约为0.5倍A325，即△A′325为0.030。
2.3.2蛋白质浓度的测定
采用紫外分光光度法测蛋白质浓度，利用在280 nm及260 nm下的光吸收值计算蛋白质的浓度，公式如下：
蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×A280-0.74×A260
式中：A280是蛋白质溶液在280 nm下测得的光吸收值；A260是蛋白质溶液在260 nm下测得的光吸收值。
2.3.3SOD的定性分析
采用紫外分光光度法：分離后的酶液与Cu/Zn-SOD标品分别在200～400 nm处进行紫外光谱扫描，根据样品与标品的紫外图谱比较，对提取物质进行定性，同时根据其最大吸收峰的波长来判断SOD的类型。
2.4SOD酶提取条件的优化
2.4.1超声时间的优化
分别对匀浆超声波处理1 min，2 min，3 min，4 min，5 min后，使用紫外分光光度法测定蛋白的浓度，并用改良的鄰苯三酚自氧化方法测定酶的活力。
2.4.2热变性时间的优化
取三份100 mL粗酶液，60℃条件下对其进行热处理，时间分别为10 min、15 min、20 min，边加热边用玻璃棒轻轻搅拌，加热完成后，迅速放入4℃冰浴冷却30 min，然后在5000 r/min、4℃下离心15 min，取上清液，分别测酶活和蛋白质含量。
2.4.3丙酮用量的優化
取热变性以后的酶液，置入4℃冰浴中，分别加入1.0倍、1.5倍、2.0倍体积的-20℃预冷丙酮进行沉淀。丙酮要缓慢加入，并用玻璃棒轻轻搅拌，以防止丙酮局部过量以及溶液产生大量的热量而使蛋白质变性。
2.5不同产地大豆的SOD酶的提取与比较
利用上述提取方法对全国9个产地的大豆进行SOD酶的提取及酶活的测定。
3.2.3丙酮加入量对酶活的影响
检测结果如表3，当丙酮加入量为1.5倍时酶活收率与比活力最高，因此本实验将丙酮加入量定为1.5倍体积。
3.3SOD活性的测定优化
3.3.1A液pH值对邻苯三酚自氧化速率的影响
检测结果如表4所示。从表中数据可以看出，邻苯三酚自氧化速率随pH的升高而增大，在pH值在8～8.4范围内，曲线几乎不变，斜率较低，pH变化对邻苯三酚自氧化速率的影响不大。当pH值超出此范围时，曲线斜率变大，微小的pH变化都会显著影响邻苯三酚自氧化速率。本实验A液最佳PH值定为8.2。
3.3.2邻苯三酚加入量对测量的影响
4讨论及结论
大豆样品经粗提取和热变性、丙酮沉淀后的蛋白质紫外光谱如图1（b）所示。由图1可以看出Cu/Zn-SOD标准品图1（a）与样品图谱的走势、峰形及出峰位置基本一致，可确定提取物质为SOD。图形的差异是由于Cu/Zn-SOD的来源不同，标准品来源于牛血细胞，出峰位置在258 nm处，而待测样品来源于大豆，出峰位置在260 nm。
SOD的测活方法有很多，在这些方法中，邻苯三酚自氧化法仪器简单、测试方便，因而是使用较普遍的一种方法。目前采用的邻苯三酚测活方法有两种，一种是经典的邻苯三酚自氧化法，另一种是改进的微量邻苯三酚自氧化法。本文SOD活性的测定采用后者，该方法以修改的Marldund方法广泛用于食品中SOD活性测定，方法灵敏，操作简易，易于推广。
超声波实验的结果显示，最佳的超声波时间是4 min。因为在一定的条件下，超声波时间过短不能使细胞破碎，因而其中的酶不能完全溶出；因为大多数酶也是蛋白质，如果超声波时间过长就会破坏蛋白的结构，酶也就会失去活力。故超声波时间应该严格控制。热变性试验可以去除一定量的杂质蛋白，热变性的过程中不需要接触有机溶剂，在节省成本的同时，减少了对环境和人体的危害，增加了工作的安全性，所以热变性法是去除杂蛋白的一种高效、简便、安全的方法。丙酮沉淀方法的优势在于丙酮本身为易挥发的有机溶剂，离心除去上清后沉淀，避免了透析等一系列的繁琐步骤，可以直接干燥而得到最终的产物；但同时也有一定的弊端，即会给环境带来污染。
本文对9个不同产地的大豆SOD酶进行了提取、蛋白量的测定、酶活力的测定。结果显示：各个产地大豆SOD酶活性有一定的差异，但总体呈现一种趋势，即从我国南部到北部，大豆SOD酶的活力逐渐升高，来自黑龙江大豆中的SOD酶活性最高，更适合进行大规模的生产，并可做进一步的开发、应用研究。
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