对照组，H/R组给予缺氧6 h/复氧24 h处理，H/R+FGF21组则在细胞复氧时给予FGF21（1 μg/mL）处理。利用FCM檢测各组细胞凋亡率，QPCR及Western blot检测各组Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表达水平。 结果 H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组（P < 0.01）。与H/R组比较，H/R+FGF21组细胞凋亡率显著降低（P < 0.01）。QPCR及Western blot检测发现，与H9C2组比较，H/R组Angpt2、Caspase-3表达显著增加，GLUT1表达显著降低（P < 0.01）；与H/R组比较，H/R+FGF21组Angpt2、Caspase-3表达显著降低（P < 0.05或P < 0.01），GLUT1表达显著增加（P < 0.05）。 结论 外源性FGF21可显著减轻H/R损伤所致H9C2细胞凋亡，抑制炎症因子Angpt2表达和增加GLUT1表达可能是其内在机制。
[关键词] FGF21；H9C2细胞；缺氧/复氧损伤；Angpt2；凋亡
[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0032-05
再灌注治疗是改善急性心肌梗死患者预后的根本措施，其在增加供血、挽救濒死心肌之外，也会引起无复流、心肌细胞凋亡和坏死、再灌注心律失常、心功能恶化等，称之为缺血/再灌注（I/R）损伤。心肌I/R损伤是患者心功能恶化和不良预后的主要原因，其机制复杂，涉及心肌细胞凋亡、能量代谢障碍、炎症损伤等。成纤维细胞生长因子（FGF）21是一种内分泌型FGF，具有抗氧化应激、抗炎、改善能量代谢、抑制心肌凋亡等心血管保护作用[1]，但其内在机制仍不完全清楚。
葡萄糖转运体（GLUT）1是调节心肌细胞有氧糖代谢的关键步骤，是一种内源性保护因子。血管生成素2（Angpt2）是血管生成素家族中最为重要的成员之一，Angpt2作为一种炎症因子参与了多种病理生理过程包括感染性休克、急性心肌梗死、同种异体心脏移植I/R损伤、移植心脏血管病等[2-3]。本研究利用H9C2细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型模拟心肌I/R损伤，旨在探讨外源性FGF21（rhFGF21）对H9C2心肌细胞H/R损伤的保护作用及对Angpt2和GLUT1表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 H9C2细胞购买于ATCC（CRL-1446）。
1.1.2 主要试剂 rhFGF21（美国ABNOVA，P5989，纯度> 95%）；DMEM-高糖培养基（Hyclone，Cat.No.SH30022.01B）；胎牛血清（Gibco，Cat.No.10099-141）；Annexin V/PI apoptosis kit（联科生物，AP101）；Trizol（TAKARA公司产品）；RT-PCR试剂（DBI公司产品）；RNasin（美国Promega公司产品）等。
1.1.3 实验仪器 低速离心机（Anke/飞鸽，TDL-80-2B）；CO2细胞培养箱（Memmer，INC108）；缺氧复氧培养箱（SANYO三洋，MCO-5M）；倒置显微镜（MOTIC）；流式细胞仪（BD，FACSCalibur）；酶联免疫监测仪（Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3）；Real Time PCR仪（美国Agilent公司）；SDS-PAGE垂直电泳槽（北京凯元伯乐生物科技有限公司）等。
1.2 实验方法
1.2.1 H9C2细胞H/R模型建立 将H9C2细胞接种于60 mm培养皿中，培养环境为37℃，5%CO2。当细胞密度> 90%时，用于后续实验。10% FBS的DMEM培养基更换为PBS，在缺氧复氧培养箱充入95% N2 10 min后，把缺氧复氧培养箱放入37℃的恒温培养箱中进行缺氧（O2含量约为2%）6 h，然后去掉PBS，重新加入含10% DMEM的培养基，置于37℃，20% O2， 5%CO2中继续培养24 h（即缺氧6 h/复氧24 h）。
1.2.2 给药方法 在细胞复氧时给予rhFGF21治疗，rhFGF21冻干粉直接配置于再灌注液（含10% DMEM的培养基）中，浓度为1 μg/mL，为防止其降解，现配现用，药液不做保存。
1.2.3 实验分组 实验分三组：H9C2组、H/R组、H/R+FGF21组。H9C2组即H9C2细胞阴性对照组，H/R组给予缺氧6 h/复氧24 h处理，FGF21组则在细胞复氧时给予FGF21（1 μg/mL）处理。
1.2.4 检测指标 利用流式细胞仪（FCM）检测各组H9C2细胞凋亡率，利用QPCR及Western blot检测各组H9C2细胞Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；方差不齐进行Kruskal-Wallis H检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞凋亡情况比较
H9C2组细胞凋亡率为（9.17±1.12）%（图1A）；H/R组细胞凋亡率为（38.87±3.71）%（图1B）；H/R+FGF21组细胞凋亡率为（24.80±1.95）%（图1C）；H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组（P < 0.01），H/R+FGF21组细胞凋亡率显著低于H/R组（P < 0.01）（图1D）；表明H9C2心肌细胞H/R损伤模型建立成功，FGF21干预可以显著抑制H/R损伤所致H9C2细胞凋亡。
2.2 各组Angpt2、GLUT1、Caspase-3 mRNA表达情况比较
与H9C2组比较，H/R组Angpt2 mRNA表达显著升高（P < 0.01，图2A），GLUT1 mRNA表达显著降低（P < 0.01，图2B），Caspase-3 mRNA表达显著升高（P < 0.01，图2C）；与H/R组比較，H/R+FGF21组Angpt2 mRNA表达显著降低（P < 0.01，图2A），GLUT1 mRNA表达升高（P < 0.05，图2B），Caspase-3 mRNA表达降低（P < 0.05，图2C）。
2.3 各组Angpt2、GLUT1、Caspase-3蛋白表达情况比较
H9C2组、H/R组、H/R+FGF21组细胞中Angpt2和Caspase-3的表达趋势相似，均为H/R组 > H/R+FGF21组 > H9C2组；GLUT1的表达水平由低到高依次为H/R组 < H/R+FGF21组 < H9C2组。图3。
3 讨论
细胞凋亡在心肌I/R损伤的病理生理过程中起重要作用。心肌I/R损伤通过多种机制诱导心肌细胞凋亡，比如能量代谢障碍、氧自由基增多、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症损伤等。本研究发现，H/R组细胞凋亡率显著高于H9C2组，表明H9C2心肌细胞H/R损伤模型建立成功；在细胞复氧同时给予rhFGF21（1 μg/mL）处理可以显著抑制细胞凋亡、提高存活率，表明外源性FGF21具有抗凋亡等心肌保护作用。已知细胞凋亡的途径有死亡受体介导途径、线粒体介导途径和内质网介导途径等， Caspase在各种途径介导的细胞凋亡中起着核心作用，是细胞凋亡激活的必由之路，Caspase-3处于细胞凋亡信号通路的下游，是凋亡通路中的重要信号分子，Caspase-3断裂激活能直接水解底物，包括细胞质和细胞核内与DNA修复、复制，RNA剪切和细胞骨架等相关的蛋白质，并导致细胞凋亡。因此Caspase-3常作为细胞凋亡的检测指标。本研究利用QPCR和Western blot检测Caspase-3表达，结果显示，H/R损伤诱导Caspase-3表达显著增加；给予rhFGF21处理后能显著抑制Caspase-3表达，说明rhFGF21可以通过某些通路抑制Caspase-3的断裂激活，从而抑制细胞凋亡。
FGF21是近年来新发现的一种FGF，属于FGF家族（FGFs），主要由肝脏、脂肪组织、胰腺、骨骼肌等分泌，作为一种内分泌激素调节糖脂代谢，增加胰岛素敏感性，保护胰岛β细胞功能，降低体重和改善肝脂肪变性等，且无增殖、低血糖、水肿等副作用，有望成为一种新的降糖、调脂和治疗肥胖的药物。GLUT是细胞膜上的一种跨膜糖蛋白，负责葡萄糖跨膜转运，在心肌中表达的GLUT形式主要有GLUT1和GLUT4。心肌缺血时位于细胞器膜的GLUT1和保存于囊泡内的GLUT4迅速转移到细胞浆膜，使心肌细胞摄取更多的葡萄糖以代偿缺血心肌能量利用失衡。GLUT1是FGF21作用底物之一，GLUT1是心肌细胞摄取葡萄糖的限速步骤，现已知增加心肌细胞葡萄糖摄取和糖酵解代谢可以抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。本研究初步探讨了GLUT1在心肌细胞H/R损伤中的改变及rhFGF21干预对其的影响。本研究利用QPCR和Western blot检测发现H/R抑制心肌细胞GLUT1表达，而给予rhFGF21处理可显著增加GLUT1表达。目前认为GLUT1在心肌缺血、缺氧时可作为一种内源性保护因子[4-6]。FGF21上调H9C2细胞GLUT1表达可能通过以下机制发挥心肌保护作用：①GLUT1表达增加将增加心肌细胞复氧时对葡萄糖的摄取，抑制脂肪酸氧化，优化细胞能量代谢[7]；②GLUT1作为缺氧诱导因子（HIF-1α）、Akt下游靶基因，推测FGF21通过Akt-GLUT1-cJNK途径抑制凋亡等[4，7]；③通过激活线粒体ATP敏感性钾通道，维持心肌细胞和线粒体膜稳定性，保护线粒体功能，减少再灌注心律失常等[8]。
此外，炎症在I/R损伤和细胞凋亡的发生、发展中也起重要作用，心肌I/R时可刺激血管内皮细胞和心肌细胞等表达和分泌炎症介质或细胞因子，比如TNF-α、ICAM-1、IL-6、VEGF等，引起白细胞黏附、聚集和激活，导致细胞组织损伤和无复流等微循环障碍。基础研究也发现，FGF21可通过抗炎、促血管生成等机制发挥抗I/R损伤等心血管保护作用，但其内在机制并不完全清楚。近年来，兼有促血管生成和致炎作用的Angpt2在心肌I/R损伤中的作用日益引起重视[2]，已有学者将其作为判断病情严重性与预后的一种新型标志物和炎症分子[9-12]。多数研究提示，在心肌I/R损伤时Angpt2表达增加并发挥促凋亡作用[13-16]。本研究首次探讨了H9C2心肌细胞H/R损伤及rhFGF21干预对Angpt2表达的影响。研究发现，H9C2心肌细胞H/R损伤可以显著增加Angpt2表达，而FGF21减轻H/R损伤同时显著抑制Angpt2表达，提示抑制Angpt2表达可能是FGF21抗凋亡的心肌保护机制之一。但目前Angpt2促凋亡机制并不清楚，有待进一步研究揭示。
目前文献报道涉及FGF21抗心肌凋亡作用的细胞内传导途径和机制主要有以下几个方面：①FGF21可以内分泌激素形式作用于心肌，通过激活FGFR1/β-Klotho-PI3K-Akt1-BAD细胞内信号网络，最终抑制Caspase-3活性而减少心肌细胞凋亡[17-18]；②外源性FGF21通过Akt-GSK-3β-Caspase-3依赖的信号转导途径减轻H9C2细胞I/R损伤，减轻氧化应激、改善能量代谢，抑制TNF-α和PAI-1等炎症因子表达[19]；③骨骼肌来源的FGF21可以脂联素依赖方式显著减轻鼠心肌梗死，改善心功能，减少心肌细胞凋亡，促进血管生成及抑制炎症因子释放等[20]。
總之，外源性FGF21可通过上调GLUT1表达改善细胞能量代谢，以及下调促炎因子Angpt2表达等机制，显著减轻H/R损伤所致H9C2细胞凋亡，具有抗心肌I/R损伤的有益作用。
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（收稿日期：2016-10-29 本文編辑：李亚聪）
