[摘要] 目的 研究运用改良酚-氯仿法从甲醛固定组织中提取DNA的方法，对比心、肝、肺、脑4种脏器DNA提取质量的优劣，从而了解哪种经甲醛固定后的组织易于得到质量较为可靠的DNA，以达到对DNA扩增及后续研究的目的。方法 选取甲醛固定标本脏器各14例，以蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取检材中DNA，对所得DNA质量以紫外分光光度计、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析进行结果判断。结果 心、肝、肺、脑4种组织所提DNA的OD260/OD280比值分别为（1.842±0.380）、（1.861±0.076）、（1.387±0.113）、（1.428±0.087）。每100毫克组织中DNA含量（μg）分别为（0.944±0.530）、（1.096±0.544）、（0.348±0.273）、（0.601±0.238）。PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析显示，心肌和肝脏组织的条带清晰度高于肺脏和脑组织。结论 经甲醛浸泡固定的心肌组织和肝脏组织，运用改良酚-氯仿法所得DNA质量较为可靠，可以用于后续研究。
[关键词] 法医病理学；甲醛固定；改良酚-氯仿法；DNA提取
[中图分类号] R91 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（b）-0116-03
检材中DNA的提取是法医学中常用的一项技术，同时也是分子生物学中研究基因功能的重要步骤[1]。目前，从新鲜组织中提取高质量DNA的技术已经比较成熟，但由于某些疾病的新鲜标本获取较为困难，使通过新鲜组织进行DNA水平的研究相对受限。在国内，几乎所有的医院及司法鉴定机构等都存在大量的经甲醛直接浸泡固定的组织，其获取和保存较容易[2-3]，然而这些组织中的DNA因甲醛的影响降解相对严重，从中提取高质量的DNA非常困难，能否成功提取这些组织的DNA往往在医疗纠纷及刑事案件中起着举足轻重的作用。在前期研究中本研究发现通过改良酚-氯仿法较其他方法更容易从甲醛固定组织中提取出DNA，使得从组织中提取DNA开辟了一条新的途径[4]，不过此提取方法在不同脏器组织所得DNA 的质量及效率上是否存在差异，其相关研究报道较少。本实验采用改良蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取经甲醛固定的心、肝、肺、脑四种常见脏器的DNA，并对其结果进行分析，以期发现使用经甲醛浸泡固定的何种脏器更易于得到质量较为可靠的DNA以用于后续研究。
1 材料与方法
1.1 材料
搜集2009～2012年山西医科大学司法鉴定中心经10%甲醛固定的标本14例，每例分别取心、肝、肺、脑4种组织，共56例样本，均按同一种方法进行DNA提取。
1.2 方法
从甲醛固定的每例样本中切取100 mg，用蒸馏水冲洗后在干燥研钵内碾磨碎，再用2×蔗糖-Triton洗涤，1000 r/min离心15 min，弃去上清液，沉淀用3 ml TE 缓冲液（pH 9.0）打匀，加SDS 1 ml，加蛋白酶K，在48℃水浴摇床中保温48 h。取上清液，依次用等体积苯酚、氯仿，苯酚/氯仿（1∶1）在4℃条件下14 000 r/min离心10 min，重复2遍。取上清液，加入预冷2倍体积的无水乙醇以及1/10体积的3mol/L NaAc，颠倒混匀置于-20℃环境下30 min。4℃条件下14 000 r/min离心10 min。弃去上清液，得到DNA沉淀，用70%乙醇洗涤2遍，14 000 r/min离心5 min，自然干燥沉淀。加TE（pH 8.0）在4℃条件下过夜。-20℃保存备用。
1.3 DNA的测定
1.3.1 测定DNA的浓度 将上述方法提取的DNA样品经紫外分光光度计于260 nm和280 nm处分别读取其吸光度（A）值，DNA的纯度可根据OD260/OD280比值计算。
1.3.2 PCR的扩增 PCR反应体系为20 μl，其中Premix Taq 10 μl，DNA模板与去离子水混合体系8 μl，引物（GAPDH，上游：5"-CAACAGCGACACCCACTCCT-3"，下游：5"-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3"）2 μl。PCR反应条件：98℃条件下变性10 s，60℃条件下退火30 s，72℃条件下延伸60 s，循环次数为30次。
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）试验 取扩增产物9 μl，加入PBE缓冲液 1 μl及Maker 6 μl同时上样，经3.0%的AGE（100 V，40 min），在紫外凝胶成像系统下观察所得DNA的PCR扩增结果。
2 结果
2.1 4种组织所提取DNA的OD260/OD280值及其质量的比较
在DNA的提取过程中，由于甲醛的影响因素，心肌、肺脏、脑组织所得DNA沉淀均很难用肉眼可见，而肝脏组织可见少量絮状沉淀。经紫外分光光度计得到4种组织所提取DNA的2.2 4种组织所提取DNA模板的PCR扩增的比较
4种组织所提 DNA 以GAPDH为引物扩增，在3.0%的AGE中图谱显示，心肌、肝脏、肺脏和脑组织所得DNA模板均可扩增出目的条带，而肺脏与脑所得DNA模板扩增的目的条带亮度低于心肌与肝脏所得DNA模板扩增的目的条带亮度（图1）。
研究结果提示，取自不同年份的14例心脏组织样本通过改良酚-氯仿法所得DNA均扩增出了清晰的目的条带，说明经甲醛固定的心脏组织在4年内无明显降解（图2）。
3 讨论
甲醛是分子量最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，发挥对组织固定的作用，因其操作简单，保存效果好，常应用于固定保存法医病理标本。然而甲醛固定液同时对DNA分子会产生不利的影响，甲醛介导的DNA损伤在固定3 h后就明显发生，固定时间越长，甲醛所致的DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA，而且甲醛与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境pH，从而影响DNA分子的稳定性。此外，甲醛固定标本的DNA降解成不同长度的片段，也不利于模板DNA进行PCR扩增反应[5-6]。因此，从甲醛固定组织中获得高质量的NDA就成为后期研究的关键步骤。目前，多数研究者从改变提取方法的角度进行研究如何提取高质量的DNA，而忽略了寻找何种组织更容易提取高质量的DNA。本研究正是着眼于甲醛对不同时间、不同组织中DNA提取的影响进行研究。
一般认为从肝脏组织和脑组织提取的DNA量较少，而从心肌组织提取的DNA量较多[7-8]。这是由于心肌组织比其他组织含有较多的线粒体，因此，可以从肌肉组织中提取更多的线粒体DNA。本研究应用改良酚-氯仿法不仅从心肌组织得到质量较优的DNA，并且所得肝脏组织DNA的纯度、质量及PCR扩增结果也非常好，均优于其他两种组织。这可能是因为DNA含量造成的，由表1可以看出肝脏的DNA含量达到（1.096±0.544）μg，在所有组织中是最高的，肺脏最低[（0.348±0.273）μg]。由于甲醛对其固定组织中DNA破坏程度与组织结构有关，结构越致密，甲醛渗透越慢，组织深层细胞DNA受到破坏就越小。而心脏和肝脏都是组织结构比较致密的脏器，肺脏相对疏松，因此心脏和肝脏受到甲醛的破坏相对肺脏较小，所得DNA的含量要相对较高。此外，因脑组织细胞聚集和纤维排列不均，实验取材要考虑脑灰质与白质，即大脑表层与内部细胞分布的不同。多数大脑神经细胞体聚集在大脑表层的灰质上，甲醛对其影响和破坏较为严重，所提取的DNA也很少。
综上所述，从甲醛固定液提取DNA并行PCR扩增相对比较困难，影响因素居多，研究还不是十分完善。本研究运用改良酚-氯仿法提取甲醛固定的心肌及肝脏组织DNA，其质量较好，适用于PCR分析，对法医病理学研究及鉴定具有一定的应用价值。
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（收稿日期：2013-04-02 本文编辑：袁 成）
