摘要：以野生蕨菜为原料，采用超声波辅助提取法，研究不同提取条件对野生蕨菜中总黄酮含量的影响及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力。首先在单因素试验基础上考察各因素对野生蕨菜总黄酮提取率的影响，然后采用正交试验优化野生蕨菜总黄酮的提取工艺条件，同时比较其与维生素C在清除DPPH自由基方面的差异。结果表明，超声辅助提取野生蕨菜中总黄酮的最优条件：超声功率240 W，料液比1 g ∶35 mL，超声时间 70 min，超声温度60 ℃。其中的显著影响因素是超声功率、超声温度，在最优条件下超声波辅助提取野生蕨菜中总黄酮的提取率可以达到 3.34%。另外，野生蕨菜黄酮类化合物对DPPH自由基的清除率比相同浓度的维生素C溶液清除率高，其IC50值为 0.005 mg/mL，说明野生蕨菜总黄酮具有很好的抗氧化活性，从而为其综合开发提供了一定的理论依据。
关键词：野生蕨菜；超声提取；总黄酮；正交试验；DPPH
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0194-04
目前有多种黄酮提取方法，但在众多方法中，有机溶剂提取法存在溶剂成本高、毒性大等缺点，大孔树脂吸附法的重现性差、预处理麻烦，酶提取法、超临界流体提取法都存在成本偏高的劣势，只有超声波辅助提取法能高效地提取蕨菜中的黄酮类物质，既能降低成本，又能缩短提取时间。但是对蕨菜黄酮的超声波辅助提取未见报道，因此本研究以野生蕨菜为对象，采用单因素试验与正交试验相结合的方法，考察超声波辅助提取野生蕨菜总黄酮的优选工艺及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力，以期为野生蕨菜的综合开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1材料
野生蕨菜，产自黑龙江伊春。
1.2试剂与仪器
芸香苷标准品（纯度>99%），购自成都市科龙化工试剂厂；DPPH，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；亚硝酸钠、无水乙醇、维生素C、硝酸铝等，均为分析纯。试验用水均为二次蒸馏水。
KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-2500紫外-可见分光光度计，日本岛津公司等。
1.3试验方法
1.3.1野生蕨菜的预处理将野生蕨菜用蒸馏水洗净，然后放于60 ℃烘箱中干燥，最后用粉碎机粉碎并过100目筛，装瓶置于阴凉处备用。
1.3.2最大吸收波长的选择野生蕨菜中的黄酮类物质中含有游离的羟基，在一定条件下能与金属铝离子形成金属络合物而显色，所以本试验中选择硝酸铝比色法测定野生蕨菜中的总黄酮含量[3]。
准确称取100 mg芸香苷标准品，置于50 mL容量瓶中，加约30 mL 50%乙醇，在水浴中加热溶解，放冷，加50%乙醇稀释到刻度，混合均匀，准确量取5 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混合摇匀，即得0.100 mg/mL芸香苷标准乙醇溶液。
准确量取2.0 mL芸香苷标准溶液于25 mL比色管中，加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液，混合摇匀，静置6 min再加 1.0 mL 10%硝酸铝溶液，混合均匀，静置6 min，最后加 10.0 mL 4%氢氧化钠溶液，加50%乙醇定容后，混合均匀，静置15 min。取另一个比色管加1 mL 5%亚硝酸钠，再加1 mL 10%硝酸铝，最后加10 mL 4%氢氧化钠，加50%乙醇定容至刻度作为空白对照，在200～800 nm波长范围内进行紫外扫描，由图1可见，在513 nm处有最大吸收峰，因此本试验选择513 nm为测定波长。
1.3.3芸香苷标准曲线的绘制准确量取芸香苷标准品乙醇溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL比色管中，加1.0 mL 5%亚酸钠溶液，混合均匀， 静置 6 min，
然后加1.0 mL 10%硝酸铝溶液，混合均匀，静置 6 min，再然后加10 mL 4%氢氧化钠溶液，最后加50%乙醇定容到刻度，混合均匀，静置15 min，在波长513 nm处测定吸光度。由图2可知，回归方程为A=10.993C-0.000 7，r2=0.997。结果表明，芸香苷标准品浓度在4～24 μg/mL 范围内，吸光度与浓度线性关系良好。
1.3.4样品的测定[4]准确称取1.000 0 g野生蕨菜于锥形瓶中，超声提取，常压过滤，用乙醇溶剂洗至滤液无色即得到待测液。准确移取2.0 mL野生蕨菜待测液于25 mL比色管中，用“1.3.2”节的显色方法测定吸光度，代入标准方程计算野生蕨菜中总黄酮含量和提取率，其中总黄酮含量的计算公式：总黄酮含量=（提取液中总黄酮的质量/样品质量）×100%。
1.3.5单因素试验[5]（1）超声功率对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响。准确称取5份野生蕨菜粉末，每份 1.000 0 g，分别加入30 mL 70%（体积分数）乙醇，超声温度为50 ℃，分別在160、200、240、280、320 W的功率下超声提取40 min，常压过滤至滤液无色，测量提取液体积并取2.0 mL提取液于25 mL比色管中，采用硝酸铝比色法测定溶液吸光度，计算蕨菜的总黄酮含量。
（2）料液比对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响。准确称取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分别加入25、30、35、40、45 mL 70%（体积分数）乙醇，在超声温度为50 ℃、超声功率为240 W的条件下超声提取40 min，其余步骤同（1）。
（3）超声时间对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响。准确称取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分别加入30 mL 70%（体积分数）乙醇，分别在50 ℃超声温度、280 W超声功率下超声提取30、50、70、90、110 min，其余步骤同（1）。
（4）乙醇浓度对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响。准确称取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分别加入30 mL体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在280 W超声功率、50 ℃超声温度下超声提取90 min，其余步骤同（1）。
（5）超声温度对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响。准确称取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分别加入30 mL 60%（体积分数）乙醇，分别在25、30、40、50、60 ℃温度下以280 W的超声功率超声提取70 min，其余步骤同（1）。
1.3.6正交试验[6]在单因素基础上，选取超声功率、料液比、超声时间、超声温度作为考察因素，以野生蕨菜中总黄酮含量为目标，每个因素设3个水平，采用L9（34）的正交设计试验，因素水平设计如表1所示。
1.3.7野生蕨菜中总黄酮与维生素C分别清除DPPH自由基的测定（1）蕨菜总黄酮清除DPPH自由基测定。准确称取25 mg DPPH，用无水乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，制得DPPH母液，于冰箱中避光保存，用时稀释5倍，得 50 mg/mL DPPH溶液。另将野生蕨菜提取液分别配成 0.026 4、0.021 1、0.015 8、0.010 6、0.007 9、0.005 3、0.004 0、0.002 6、0.001 3 mg/mL 9个浓度，反应30 min后于1 cm比色皿中测定其在517 nm处的吸光度。
（2）维生素C清除DPPH自由基测定。准确称取 26.4 mg VC，用60%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，制得VC母液，取10 mL母液稀释于50 mL容量瓶中，得 0.052 8 mg/mL VC溶液。VC浓度梯度与DPPH自由基清除试验中蕨菜浓度一致，反应30 min后于1 cm玻璃比色皿中测定其在517 nm处的吸光度。
按下列公式计算DPPH自由基的清除率：清除率=[1-（Ds-Dc）/D0×100]×100%，其中抗氧化剂清除自由基能力采用清除率为50%时所对应的抗氧化剂溶液浓度（即IC50值）表示。式中：D0为4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+ 1.0 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ds为4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+1.0 mL不同浓度样品溶液的吸光度；Dc为 4.0 mL 无水乙醇溶液+1.0 mL不同浓度样品溶液的吸光度[7]。
2结果与分析
2.1单因素试验分析
2.1.1超声功率对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响如图3所示，在160～240 W超声功率范围内，野生蕨菜中总黄酮的提取率缓慢升高；在240～280 W超声功率范围内，提取率迅速提高，在280 W超声功率处理下，野生蕨菜中总黄酮的提取率达到最大值；但从280 W超声功率开始，提取率急剧下降，这可能是因为超声功率达到一定程度时会破坏黄酮类分子的结构，使黄酮含量降低[6]。因此，确定280 W为最佳超声功率。
2.1.2料液比对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响如图4所示，在料液比1 g ∶25 mL～1 g ∶30 mL的范围内，野生蕨菜中总黄酮的提取率逐渐提高，但从料液比为1 g ∶30 mL开始，溶剂越多，野生蕨菜中总黄酮的提取率急剧降低。这可能是由于随着溶剂的增多，所溶解的杂质也增多，从而使黄酮提取率降低。综合提取效果与减少溶剂用量等方面[8]，确定最佳料液比为1 g ∶30 mL。
2.1.3超声时间对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响如图5所示，野生蕨菜中总黄酮的提取率随着超声时间的增加呈现先提高后降低的趋势，这可能是由于过长的提取时间破坏了黄酮类化合物的结构，降低了总黄酮的含量。所以，确定最佳超声时间为70 min。
2.1.4乙醇浓度对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响如图6所示，野生蕨菜中总黄酮的提取率随着乙醇浓度的增加呈现先提高后降低的趋势，这可能是由于高浓度乙醇溶解了部分脂溶性化合物，导致溶解黄酮化合物的能力降低[5]。因此，确定最佳乙醇浓度为60%。
2.1.5超声温度对野生蕨菜中总黄酮提取率的影响如图
7所示，野生蕨菜中总黄酮的提取率随着超声温度的逐渐上升呈现先提高后降低的趋势，这可能由于温度过高，溶剂挥发，使得野生蕨菜中总黄酮提取率降低[5]。所以，确定50 ℃为最佳超声温度。
2.2正交试验结果
根据表2正交试验结果可知，各因素对野生蕨菜总黄酮提取率影响大小顺序为D>A>C>B，即超声温度>超声功率>超声时间>料液比，野生蕨菜中总黄酮超声提取最佳的条件组合为A1B3C2D3，即超声功率240 W，料液比 1 g ∶35 mL，超声时间70 min，超声温度60 ℃。由表3分析可知，显著的影响因素是超声功率和超声温度。
2.3验证试验
为了更好地考察正交试验的最优工艺的稳定性，根据分析结果，选取最优提取条件即超声功率240 W，料液比
2.4蕨菜中总黄酮与维生素C分别清除DPPH自由基
DPPH自由基作為一种十分稳定、能长时间保存的自由基，当它在适当的介质条件下会被还原[9-10]，消除了该自由基，溶液中化合物的颜色会由原来的紫色变成淡黄色[11]。
如表4、图8所示，清除DPPH自由基的能力随着维生素C质量浓度的增加在逐渐增强：当维生素C的质量浓度达到 0.021 1 mg/mL 时，维生素C的清除率达到75.83%，其清除能力也趋于稳定状态，维生素C清除率达到IC50值所对应的浓度为 0.014 mg/mL。清除DPPH自由基的能力随着蕨菜总黄酮质量浓度的增大而增强，当质量浓度达到 0.015 8 mg/mL 时，其清除率达到87.96%，且趋于稳定，野生蕨菜清除率达到IC50值所对应的浓度为 0.005 mg/mL[12-18]。因此表明，蕨菜中黄酮类化合物可以较好地清除DPPH自由基，同时也说明其清除能力比维生素C强。
3结论
超声辅助提取野生蕨菜总黄酮的最优条件为乙醇浓度60%，超声功率240 W，料液比1 g ∶35 mL，时间70 min，超声温度60 ℃。根据正交试验结果分析可知，超声功率、超声温度对野生蕨菜中总黄酮的提取率具有显著影响。
野生蕨菜总黄酮对DPPH自由基具有很好的清除能力，其IC50为0.005 mg/mL，表明野生蕨菜总黄酮具有较强的抗氧化活性。
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