枸杞叶片中类黄酮的提取工艺研究

材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

材料选择由宁夏银川南梁农场枸杞基地种植的宁杞1号鲜叶。试剂选用芦丁、2-氨乙基-二苯基硼酸盐、95%乙醇，所用试剂均为分析纯。仪器为上海化学分析公司生产的GFY-160荧光分光光度计；日本岛津公司生产的UV-2401 PC紫外-可见分光光度计；上海纤检仪器有限公司生产的SZC-C脂肪测定仪；常州国华电器有限公司生产的微波炉；上海亚荣生化仪器厂生产的KQ5200超声波清洗器；上海亚荣生化仪器厂生产的HY-6双层调速振荡器。

1.2 方法

1.2.1 类黄酮提取。①枸杞叶片样品的制备方法。将枸杞鲜叶放置在自然光下晾晒5 d，然后置于烘箱中干燥2 h（保持105 ℃）后再粉碎至1 mm的枸杞叶粉，待用。②提取类黄酮方法：一是常温浸提法。准确称量10 g枸杞叶粉于100 mL具塞三角瓶中，加入95%酒精75 mL，在25 ℃浸泡48 h，过滤，再用适量石油醚对滤液进行萃取，留下下层液体。采用减压浓缩法剔除掉溶剂以后用95%乙醇定容至250 mL，即为常温浸提法类黄酮提取液。二是加热浸提法。称取10 g枸杞粉于100 mL容量瓶中，加入不同体积的95%酒精，于50、60、70、90 ℃浸提2 h，过滤，定容。其他操作同“常温浸提法”。三是微波提取法。准确称量10 g枸杞叶粉于100 mL具塞三角瓶中，加入95%酒精75 mL，在60 ℃、400 W的功率下，用微波炉提取10 min。其他操作同“常温浸提法”。四是超声波提取法。准确称量10 g枸杞叶粉于具塞三角瓶中，加入不同体积的95%酒精，在超声波清洗器中于30、40、50 ℃处理不同时间，过滤，定容。其他操作同“常温浸提法”。

1.2.2 测定类黄酮含量。测定枸杞叶中类黄酮的含量，方法同参考文献[1]。选芦丁为标准物，1% AlCl3-甲醇溶液为显色剂，在418 nm下进行紫外检测。提取率公式为：

提取率（%）=■×100

2 结果与分析

2.1 提取物的吸收光谱

用紫外可见分光光度计检测枸杞叶片的提取物，可以得到吸收光谱（图1），提取物在210.6、291.5 nm出现2个显著的类黄酮吸收峰，说明该提取物中含有类黄酮物质。

2.2 类黄酮含量

该试验以芦丁为标准物表示枸杞叶片提取物中类黄酮的含量，结果为（897±30）mg/kg。枸杞叶片的95%乙醇提取物内的成分较多，相较而言，枸杞叶片中类黄酮物质极其丰富。

2.3 类黄酮提取条件的选择

2.3.1 固液比、温度、时间对类黄酮提取率的影响。分别在50、60、70、90 ℃的温度下用95%乙醇对不同的固液比进行类黄酮的提取，将收集到的乙醇提取液用紫外可见分光光度计进行检测，根据291.5 nm吸收峰处吸光度来比较固液比、温度、时间对类黄酮提取率的影响[2]。结果发现，提取溶剂增多，类黄酮提取量也较多。在固液比为1∶10时，提取效果最好，继续增加溶剂用量，提取效果又会明显变差（图2）。

在常温（20 ℃）条件下浸泡24 h后，提取液在292.5 nm处吸光度为0.597，提取效果较差。分别在50、60、70、90 ℃加热提取时，相同时间，温度越高，效果越好。在90 ℃提取时，在2 h左右达到最大（图3），且效果比4 h还好，这可能是类黄酮物质的热稳定性差，易于分解所致。

2.3.2 微波处理法。微波辐射能穿透材料，进入组织内部使分子振动，并产生热量。结果发现，微波法提取效果最好，时间缩短[3]。加热法70 ℃ 4 h（最大吸光度0.939，图3）与中高火60 s（最大吸光度0.963，图4）提取率较为接近。持续增大微波功率，当达到最大提取效果时其时间最短，但也会相应导致溶剂损失。

2.3.3 超声波处理。超声波在工作时产生的强烈振动、空化效应、高加速度及搅拌作用等都可加速溶剂吸收有效成分，从而缩短提取时间，增加提取率。

以292.5 nm的吸光度为考察指标（表1），分别进行不同的固液比、时间、温度来提取枸杞叶片中的类黄酮。采用正交设计助手IIV3.1进行超声波处理对提取温度、时间、固液比等多因素的研究。固液比1∶10、50 ℃和30 min分别为单因素最佳（均值最大）。利用超声波提取的最佳工艺条件参数为固液比1∶10、50 ℃和10 min。

对表1结果进行方差分析后得出表2。可以看出，各因素对类黄酮提取效果的影响为：温度<提取时间<固液比（F比依次增大）。各因素对类黄酮提取效果的影响均未达到显著（p<0.05）。

2.3.4 各类提取法比较。比较291.5 nm吸光度及提取时间，以吸光度最大的为100%。比较4种提取方法[4]，加热法效果最好，常温法效果最差且时间最长，微波法时间最短（表3）。

3 结论

宁夏枸杞叶片中含有较多类黄酮，在清除羟自由基、超氧阴离子自由基时效果较好[5-8]。加热法提取类黄酮效果最佳，耗时较少。微波法时间最短，但是溶剂损失较多，超声波也能缩短类黄酮的提取时间，但是其类黄酮的提取率难以提高。最佳工艺条件参数为固液比在1∶10、温度为90 ℃，提取2 h可以得到较多的类黄酮物质[9-12]。建议综合运用上述进行类黄酮提取，效果较好。

4 参考文献

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