材料与方法
1.1 供试材料
粗木醋液，以杂木为原料，市售。
菌种为青霉菌（Penicillium sp）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae），由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器 GC-MS6800型气相色谱-质谱联用仪、KQ118型超声波清洗器、DZK-C型数显恒温水浴锅、PGX-150A型智能光照培养箱、VD-650型桌上式净化工作台、LDZX-50型立式压力蒸气灭菌器、SHZ-DⅢ型循环水真空泵、RE52CS型旋转蒸发器、PHS-3C型酸度计。
1.2.2 试剂 活性炭、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蔗糖、氯化钾、硝酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁、无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氢氧化钠、氨水等。
1.3 木醋液的精制方法
粗木醋液静置3个月，采用虹吸法吸取中间层澄清液，加入5%活性炭，超声振荡10 min，静置36 h，抽滤3次，得精制木醋液[8]。
1.4 木醋液的成分分析方法
取粗木醋液与精制木醋液各100 mL，分别用30 mL无水乙醚萃取6次，低温浓缩，用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行检测。
气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱，进样口温度280 ℃，柱温40 ℃，载气He，恒温 2 min后，以5 ℃/min的速度升温至220 ℃，保留时间35 min，检出器FID。
质谱条件：EI源，电子能量70 eV，加速电压0.9 kV，源温230 ℃，扫描范围m/z 10～350。
质谱标准库：NIST库[9]。
1.5 木醋液的有效抑菌时间和抑菌性能测定
木醋液有效抑菌时间和抑菌性能的测定采用滤纸片法[10]。每隔固定的时间测量其抑菌圈直径，抑菌能力的强弱由抑菌圈直径表示，至抑菌圈直径不变为止，此时为有效抑菌时间。稀释木醋液的抑菌性能的测定，以长菌部分的面积占培养基总面积的百分比来表示不同浓度的木醋液对菌种的抑制能力。
1.6 精木醋液的再处理方法
1.6.1 梯度调节木醋液pH 采用饱和NaOH、氨水调节精制木醋液pH为3、4、5、6、7，供抑菌试验用[11]。
1.6.2 梯度稀释木醋液 将精制木醋液与无菌水分别按精制木醋液∶无菌水（V/V）=1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50、1∶70、1∶100的比例配制成濃度不同的木醋液供抑菌试验用[12]。
1.6.3 减压蒸馏木醋液 将精制木醋液放入旋转薄膜蒸发仪中进行旋蒸，参数为T=35、40、50、60、85 ℃，P=0.095 MPa，n=35 r/min。直至无蒸出物为止，得到的残留液和馏出液，供抑菌试验用[13]。
1.6.4 萃取剂萃取木醋液 取3份精制木醋液100 mL，分别用无水乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯30 mL进行萃取，萃取6次，得到乙醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层木醋液和水层剩余液，供抑菌试验用。取乙醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层木醋液平均分为8份，分别经不同浓度的NaHCO3溶液萃取，将水层酸化至原木醋液酸值，再以3种萃取剂萃取酸化后的水层，以酸碱滴定法测定组分中酸性物质的含量[14，15]。
2 结果与分析
2.1 木醋液的基本理化性质与成分分析
木醋液的直观感受呈黑褐色，伴有木焦味、烟熏味，pH为2.20～3.35，相对密度为0.9 g/cm3。
2.1.1 粗木醋液的成分分析 粗木醋液的GC-MS共检出71种物质，占整个出峰面积的17.51%，其中有机酸类有7种，占总含量的9.10%，在所有单一化合物中乙酸的含量最高，达到8.78%。酚类有14种，占总含量的1.18%。酮类有16种，占总含量的2.08%。醇类有8种，占总含量的2.80%。其他物质包含胺、脂、醛等，占总含量的0.86%。粗木醋液中有机酸、酚类、酮类、醇类的含量都很高。
2.1.2 精制木醋液的成分分析 精制木醋液的GC-MS共检出21种物质，占整个出峰面积的22.35%，其中有机酸类有6种，占总含量的11.44%。酚类有3种，占总含量的0.88%。酮类有2种，占总含量的0.56%。醇类有2种，占总含量的0.28%。呋喃1种，占总含量的0.47%。烯烃类1种，占总含量的0.64%。胺类有4种，占总含量的0.44%。酯类有2种，占总含量的7.64%。其中乙酸在所有单一化合物中的含量最高，达到9.40%。
对比成分分析结果可知，精制木醋液的有机酸含量比粗木醋液的有机酸含量高，酚类、酮类、醇类物质的含量均有下降，且酮类、醇类物质的含量下降幅度较大，精制木醋液中无醛类、丙基肼、1，4，5，6-四氢吡啶-3-腈、1-甲基-2-乙烯基-1H-咪唑等有害物质。
2.2 木醋液对霉菌的有效抑菌时间和抑菌效果对比
由图1可知，粗木醋液和精制木醋液对霉菌的抑制趋势相近，青霉菌、米曲霉菌在42 h前生长缓慢，仅凭肉眼看不到明显的菌落，也无抑菌圈，48 h后开始大量生长，长出肉眼可见的菌落，出现非常明显的抑菌圈，然后随着时间的增加抑菌圈一直在小范围缩小，基本对抑菌圈的直径改变不大，一直持续到60 h后基本不变。因此，有效抑菌时间为48 h左右。
由图2可知，粗木醋液处理过的抑菌圈要比精制木醋液处理过的抑菌圈直径大1 mm左右，结合显微镜观察发现精制木醋液的抑菌圈虽稍小但其形状规则光滑，结合成分分析精制木醋液不含无用和有害的成分，更安全可控，后续试验中选择精制木醋液用于开展抑菌试验。
2.3 再处理木醋液对霉菌抑制效果的影响
2.3.1 梯度调节木醋液pH的抑菌效果 由图3可知，精制木醋液抑菌效果与pH呈负相关，pH为4时的抑菌效果最优，pH为中性时无抑制米曲霉菌效果，pH大于6时，无抑制青霉菌效果。这与尉芹等[16]结论一致，说明木醋液中的酸性物质对木醋液的抑菌能力起主导作用，是多种有效成分参与的综合作用。
2.3.2 梯度稀释木醋液对霉菌的最低抑菌浓度 由图4可知，精制木醋液稀释后对霉菌的抑制效果与稀释浓度呈负相关。木醋液对霉菌的最低抑菌浓度为V精制木醋液∶V灭菌水=1∶20时，实际应用中建议采用体积比为1∶10以上的稀释木醋液以保证抑菌效果。
2.3.3 减压蒸馏木醋液抑制霉菌效果比较 由图5、图6、图7可知，残留液的抑菌效果优于馏出液。不同温度下残留液的抑菌效果从强到弱依次为60、85、50、40、35 ℃。60 ℃的残留液稀释到80倍以内，均有抑菌效果。
2.3.4 萃取剂萃取木醋液抑制霉菌效果比较 由图8可知，经萃取剂萃取过的木醋液的抑菌圈直径要远大于水层与精制木醋液，其抑菌圈直径大小表现为萃取层木醋液>精制木醋液>水层木醋液，且乙酸乙酯>乙醚>二氯甲烷。显微镜观察萃取层的抑菌圈虽大但其边缘不光滑，形状接近于圆。
由表1可知，有机酸含量表现为乙酸乙酯>乙醚>二氯甲烷，其与抑菌效果表现相符。结合其萃取层的抑菌效果与有机酸含量可知，萃取层木醋液含有木醋液中绝大多数有效抑菌成分酸类、酚类，且乙酸乙酯为最佳萃取剂。
3 小结与讨论
木醋液的直观感受呈黑褐色，伴有木焦味、烟熏味，pH为2.20～3.35，相对密度为0.9 g/cm3。粗木醋液与精制木醋液相比，粗木醋液中主要成分按含量从多到少为酸类、醇类、酮类、酚类，而精制木醋液从多到少为酸类、酚类、酮类、醇类。木醋液对霉菌的有效抑菌时间是48 h，其中酸性物质起主导作用，但也是所有有效抑菌成分的综合作用。
木醋液对霉菌的最低抑菌浓度为V精制木醋液∶V灭菌水=1∶20时，实际应用中建议采用体积比为1∶10以上的稀释木醋液。减压蒸馏处理后残留液的抑菌效果比较好，且60 ℃的减压蒸馏木醋液抑菌效果最好。经萃取剂萃取过的木醋液的抑菌效果最好的是萃取层，最佳萃取剂是乙酸乙酯。
不同的精制方法和不同的處理方法可以使木醋液更好地应用于各个行业，既能提高在各行业应用中的效果又能避免浪费。目前木醋液在农林业、食品等领域的应用越来越广，期待将来木醋液会得到更深度的开发应用。
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