[摘要] 目的 建立温肾消肿丸中毛蕊花糖苷的含量测定方法。 方法 采用高效液相色谱法，流動相：乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）；色谱柱：Hedera-ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速为1.0 mL/min，检测波长为334 nm，柱温为25℃；进样量：10 μL。 结果 毛蕊花糖苷在6.33～101.28 μg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.06%（RSD = 1.51%）。 结论 该方法简便、可靠，且重现性好，可用于温肾消肿丸的定量控制。
[关键词] 温肾消肿丸；毛蕊花糖苷；高效液相色谱法
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（c）-0108-04
[Abstract] Objective To establish a method for the verbascoside content determination in Wenshen Xiaozhong Pills. Methods High performance liquid chromatography method was used with Hedera-ODS-2 C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and a mobile phase of acetonitrile-0.8% glacial acetic acid （19∶81）. Flow rate was 1.0 mL/min， the detection wave length at 334 nm， column temperature was 25℃ and sample loop volume was 10 μL. Results The calibration curve was linear within the range of 6.33-101.28 μg/mL of verbascoside， the average recovery was 100.06% （RSD = 1.51%）. Conclusion This method is simple， reliable and repeatable， which can be used for the quantitation control of Wenshen Xiaozhong Pills.
[Key words] Wenshen Xiaozhong Pills； Verbascoside； High performance liquid chromatography
温肾消肿丸为南京军区南京总医院（以下简称“我院”）解放军肾脏病研究所研制的医院制剂，处方由车前子、赤芍等共11味中药组成，具有温肾消肿、健益脾胃的功效，临床主要用于治疗各种慢性肾炎、肾病综合征、下肢浮肿、困怠少食，长期应用不引起电解质紊乱[1-3]。原质量标准仅采用薄层色谱法（TLC）对部分药味进行薄层色谱鉴别，缺少对方中药效成分的含量控制[4-7]。本研究通过高效液相色谱法（HPLC），建立制剂中毛蕊花糖苷的含量测定方法，以进一步完善其质量标准，提高该制剂的质量标准。
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱仪、2487型紫外检测器（美国Waters公司）；十万分之一电子天平（XS105型，梅特勒尔-托利多公司）；数显恒温水浴锅（HH-6型，国华电器有限公司）。
毛蕊花糖苷（110715-200212）购自中国食品药品检定研究院；温肾消肿丸为我院制剂科生产（批号为140409、140618、140923、141219、150218）。
甲醇（美国天地）为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 Waters 1525高效液相色谱仪（双泵），2487紫外检测器；色谱柱：Hedera-ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）；检测波长：334 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 L。毛蕊花糖苷的保留时间约为11.6 min。
2.1.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷对照品2.53 mg，置于25 mL量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后即得。供试品溶液的制备：取本品细粉1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入无水甲醇100 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用无水甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。阴性样品溶液的制备：取温肾消肿丸处方饮片（除去车前子），按处方比例称取后，制成温肾消肿丸缺车前子的阴性样品，并按照上述供试品溶液的制备方法，制备成阴性样品溶液。
2.2 结果
2.2.1 专属性试验 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 L，按上述“2.1.1”项下方法进行测定[1-2]。见图1。结果表明，供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间处，有同一色谱峰，而阴性样品溶液无峰，表示无阴性干扰成分。
2.2.2 毛蕊花糖苷的线性关系 分别精密量取上述“2.1.2”项下对照品溶液0.625、1.250、2.500、5.000 mL至10 mL容量瓶中，用无水甲醇稀释至刻度。按“2.1.1”项下方法测定，记录毛蕊花糖苷的峰面积值，以对照品浓度（g/mL）为横坐标（X），峰面积值（A）为纵坐标（Y），进行线性回归。见表1、图2。结果表明，毛蕊花糖苷在6.33～101.28 g/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2.3 精密度试验 取“2.1.2”项下的毛蕊花糖苷对照品溶液，按上述“2.1.1”项下色谱条件，连续进样5次[3-5]，记录毛蕊花糖苷峰面积分值，并计算其RSD值为1.46%。结果表明，该方法精密度良好。
2.2.4 稳定性试验 取温肾消肿丸同一批号样品，按上述“2.1.2”项下方法处理后，在上述“2.1.1”項下色谱条件下，常温时分别于0、1、2、4、8 h进样测定[6-8]，记录毛蕊花糖苷峰面积值，并计算其RSD为0.91%。结果表明，样品溶液在8 h内稳定性良好。
2.2.5 重复性试验 称取温肾消肿丸同一批号样品，共5份，按上述“2.1.2”项下方法处理后，在上述“2.1.1”项下色谱条件下进样测定[9-11]，并计算毛蕊花糖苷的含量和RSD值为1.24%。结果表明，该方法重复性良好。
2.3 加样回收率试验
取毛蕊花糖苷对照品，精密称取4.92 mg于50 mL容量瓶中，加无水甲醇并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。另取已知含量的温肾消肿丸样品（毛蕊花糖苷含量为0.9364 mg/g），研碎，精密称取细粉9份，每份0.5 g，平均分成三组，分别精密加入上述“2.1.2”项下对照品溶液3、5、7 mL，按上述“2.1.2”项下方法处理后进样测定，计算毛蕊花糖苷的含量，并计算回收率和RSD值。结果平均回收率为100.06%，RSD为1.51%。见表2。
2.4 样品含量测定
取5批温肾消肿丸样品（批号为140409、140618、140923、141219、150228），按照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法，分别制备成样品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。见表3。
3 讨论
3.1 波长的选择
预实验表明，精密量取一定量的毛蕊花糖苷对照品溶液进行紫外扫描后，测得在334 nm波长下有最大吸收，故确定波长为334 nm。
3.2 流动相的选择
《中国药典》2015年版一部熟地黄[8]药材饮片中毛蕊花糖苷含量测定项下，毛蕊花糖苷的流动相为乙腈-0.1%冰醋酸（16∶84）。而本研究经预实验考察发现，该流动相条件下毛蕊花糖苷色谱峰与杂质峰分离度较差，后调整流动相为乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）时，毛蕊花糖苷色谱峰的分离度及保留时间均较好，故确定流动相为乙腈-0.8%冰醋酸（19∶81）。
3.3 毛蕊花糖苷提取条件的选择
预实验对毛蕊花糖苷的提取条件进行了考察，在提取时间（30、45、60 min）和提取溶剂用量（75倍、100倍、125倍）等条件下考察其提取得率[9]。结果发现提取时间在30 min、溶剂用量为100倍时，毛蕊花糖苷提取得率较高。
3.4 指标成分的选择
中药及其复方制剂所含化学成分数目众多[10-11]，这也是发挥多方面功效的重要物质基础，因此在质量控制中应从定性及定量等多方面进行研究，以全面控制其质量[12-15]。本研究的温肾消肿丸为处方，由十一味中药组成，所含成分众多，其中车前子为方中君药，《中国药典》2015版一部收载的车前子药材饮片质量标准中，对毛蕊花糖苷和京尼平甘酸进行了含量规定，而本实验经考察发现，京尼平苷酸含量不高，故暂选择毛蕊花糖苷作为定量指标，后期课题组将继续研究其他成分的含量测定，以不断提高该制剂的质量标准[16-18]。
[参考文献]
[1] 汤淏，唐安福，崔恩忠，等.活肾丸的质量标准研究[J].中华中医药学刊，2015，33（8）：1827-1829.
[2] 崔恩忠，唐安福，刘文雅，等.高效液相色谱法测定益肾丸中特女贞苷的含量[J].医学研究生学报，2015，28（1）：79-81.
[3] 胡北，张朝绅，姜范成，等.冠心颗粒的标准研究[J].中国医药导报，2017，14（19）：12-15，46.
[4] 陈英红，周婷婷，王颖.反相高效液相色谱法测定妇炎舒胶囊中丹酚酸B的含量[J].中国医药导报，2016，13（6）：150-152.
[5] 刘桂花，邢建国，何承辉，等.反相高效液相色谱法同时测定芪香胶囊中红景天苷、芍药苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量[J].中国医院药学杂志，2017，37（15）：1440-1443.
[6] 甘为，陈金凤，马桂芝.反相HPLC法测定复方芍红颗粒中芍药苷含量[J].中国医药导报，2016，13（18）：138-141.
[7] 黄小欧，韦瑀龙，蓝晓庆，等.HPLC法同时测定固本补肾口服液中3种黄酮[J].中成药，2017，39（8）：1730-1732.
[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：125-126.
[9] 王曙东，盛华，崔恩忠，等.清肾丸定性定量研究[J].中南药学，2014，12（7）：674-677.
[10] 吴琼，胡北，李想，等.复方酸枣仁颗粒质量标准研究[J].中国医药导报，2017，14（15）：144-147.
[11] 胡薏慧，袁舒敏，杨骏.血通胶囊质量控制研究[J].上海中医药杂志，2017，51（8）：98-102.
[12] 曹富宁.HPLC法研究金黄膏的稳定性及其质控标准[J].中国医药导报，2016，13（24）：133-136.
[13] 胡北，张朝绅，姜范成，等.冠心颗粒标准研究[J].中国医药导报，2017，14（19）：12-16.
[14] 孙承韬，张玉琴，许文，等.栝楼桂枝颗粒质量标准研究[J].江西中医药，2017，48（8）：58-62.
[15] 姚东，包永睿，王帅，等.卢黄参花胶囊质量标准研究[J].中国医药导报，2017，14（1）：8-11.
[16] 许保海，臧琛，聂其霞.关节痛丸质量标准研究[J].中医药导报，2012，3（18）：65-66.
[17] 马燕，李明春，付廷伟，等.清咽颗粒质量标准研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（1）：87-90.
[18] 朱顺娟，张喜民，彭雪晶，等.白虎汤颗粒的质量标准研究[J].药物分析杂志，2017，37（7）：1338-1345.
