对照，100 μL/孔，37℃孵育2 h;用PBST洗板，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体（用PBST进行1∶5 000稀释），100 μL/孔，37℃孵育1 h;用PBST洗板，加入TMB显色液，100 μL/孔，避光反应10～15 min后，加入终止液（2 mol/L H2SO4）50μL/孔，读取吸光值（OD 492）。经多次调整抗原包被浓度和血清稀释度后，确定GST-MAP0862抗原的最佳包被浓度，建立MAP0862抗体检测方法。并以建立的ELISA方法对高免血清抗体效价进行评定。
1.7MAP0862在临床检测上的应用
1.7.1ELISA方法检测牛群中副结核病的感染情况采集牛颈静脉或尾静脉血于促凝管中，收集血清。用爱德士的牛副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒和上述建立的MAP0862间接ELISA检测方法，分别对收集的血清进行ELISA检测。具体步骤参照试剂盒说明书和上述ELISA检测方法建立步骤。整理检测结果，对两种检测方法在副结核病检测中的特异性和敏感性进行比对分析。
1.7.2皮肤变态反应检测牛群中副结核病的早期感染情况将牛在颈夹保定的基础上进行头部安全固定，充分暴露出颈部，在颈部相聚10 cm以上的部位选取两点分别作为副结核菌素和MAP0862蛋白的注射点，剃毛。然后用电子游标卡尺测量注射点的皮肤厚度，记录数据。消毒后，在两个注射点分别皮内注入0.1 mL的副结核菌素（0.5 mg/mL）和MAP0862蛋白（0.05 mg/mL，高纯蛋白使用浓度为副结核菌素的1/10）。注射72 h后测量注射点的皮肤厚度，记录数据。分析注射前后皮肤厚度差，判断牛只副结核分支杆菌感染状态。对比结果，分析MAP0862蛋白和副结核菌素作为副结核病检测刺激原的特异性和敏感性。
1.7.3IFN-γ释放试验检测牛群中副结核病的早期感染情况无菌采集牛颈静脉或尾静脉血5 mL于含肝素锂或肝素钠的抗凝管中，轻轻颠倒混匀防止部分血液发生凝血。无菌条件下将血液分装至3个无菌离心管内，1.5 mL/支，分别加入100 μL PBS，副结核菌素（200 IU）和MAP0862蛋白（20 μg/mL），充分混匀，37℃孵育16～24 h。500×g离心10 min后，将上层血浆转移到新的离心管中。根据Prionics公司的Bovigam牛结核分枝杆菌γ干扰素ELISA检测试剂盒说明书进行接下来的ELISA检测，读取OD 450的吸光度，分析牛群的感染情况及两种刺激原在此方法应用中的特异性及敏感性。
1.7.4MAP0862蛋白在副结核病诊断中的应用前景分析汇总数据，分析MAP0862蛋白和副结核菌素在副结核病诊断中的结果符合率及各刺激原在检测中的特异性及敏感性。
2结果与分析
2.1MAP0862基因的克隆和重组质粒构建
以临床上筛选到的阳性粪便样品全基因组DNA为模板，成功扩增1 083 bp的MAP0862基因（图1），经测序鉴定正确无突变。
MAP0862重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，得到1 083 bp的目的片段（图2），BLAST比对结果显示该基因与NCBI公布的相应序列同源性均为100%，重组质粒均构建正确。
2.2MAP0862蛋白的表达与鉴定
将原核表达产物经SDS-PAGE与Western blot（图3）分析显示，His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白均已表达，且大小与预期大小（分别为44 kD和64 kD）一致。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化的His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白浓度分别为1.5 mg/mL和1.0mg/mL。
2.3MAP0862间接ELISA检测方法的建立
根据不同包被浓度下空白对照和阴性值以及不同浓度抗体与抗原的反应情况，最终确定MAP0862蛋白的包被浓度为2 μg/mL，样品OD 450≥0.25且样品OD 450/阴性OD 450≥2时认为抗体阳性，否则为阴性。利用建立的ELISA方法，测定制备的兔源多抗的效价达1∶106（图4）。结果表明MAP0862具有良好的免疫原性和反应原性。
2.4MAP0862蛋白在临床诊断中的应用
2.4.1ELISA方法检测牛群中副结核病的感染情况收集274份牛血清进行牛副结核病抗体ELISA检测，结果显示，爱德士的牛副结核分枝杆菌抗体检测试剂盒检测出抗体阳性59头份，MAP0862抗原检测出抗体阳性48头份，其中一头爱德士试剂盒检测为可疑（列入陰性群）的牛只MAP0862蛋白检测抗体阳性。两种检测方法的符合率达95.26%。具体分析结果见表1。
2.4.2皮肤变态反应检测牛群中副结核病的早期感染情况皮肤变态反应试验共检测牛只100头份，根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1084-2010》和OIE 2014年5月颁布的副结核病皮试检测判断标准：皮厚差>2 mm即判为副结核阳性，≤2 mm则为副结核阴性。结果显示副结核菌素作为检测原检测阳性11头份，MAP0862蛋白作为检测原检测阳性7头份。两者整体符合率达82.00%，但阳性符合率为0。具体分析结果见表2。
2.4.3IFN-γ释放试验检测牛群中副结核病的早期感染情况从上述检测的100头份牛只中采取51头份奶牛抗凝血进行IFN-γ释放试验检测，结果显示，副结核菌素作为刺激剂检测阳性15头份，MAP0862蛋白作为刺激剂检测阳性15头份。两者的整体符合率仅为68.63%。具体分析结果见表3。
2.4.4MAP0862蛋白在副结核诊断中的应用前景分析将皮肤变态反应和IFN-γ释放试验结果进行对比分析，结果显示以副结核菌素作为检测原，两种方法的符合率为62.75%;而以MAP0862蛋白作为检测原，两种方法的符合率达73.53%。说明在副结核病的早期诊断中MAP0862蛋白作为检测原具有较高的特异性，但相较于副结核菌素的高阳性检出率，MAP0862蛋白在副结核病的早期检测中的敏感性可能相对较低。而在抗体检测中，MAP0862蛋白作为检测原，与商品化的试剂盒检测结果的符合率较高，且其作为单一抗原，在检测的特异性上可能更有优势，因此MAP0862蛋白更适合应用于副结核病的抗体检测。
3讨论与结论
副结核病是由副结核分枝杆菌引起的反刍兽的慢性消化道疾病，以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。本病呈世界性流行，无明显季节性，主要呈散发，有时可呈地方性流行。副结核病的主要诊断方法为以副结核提纯菌素或禽结核提纯菌素为刺激原或检测原的皮试检测和ELISA抗体检测，但由于副结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合群内的主要致病菌牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的同源性较高，相互之间干扰较大，降低了检测特异性，易引起检测的假阳性。
MAP0862蛋白为副结核分枝杆菌特异性抗原，其可对副结核病进行特异性检测，不受其他分枝杆菌的影响。本研究利用大肠杆菌表达系统进行MAP0862蛋白的体外表达获得高纯MAP0862蛋白，制备高免血清并建立了ELISA特异性检测方法。利用此方法对临床样品进行检测，结果显示，本方法与商品化爱德士试剂盒检测结果的符合率达95.26%，表明此方法具有较好的特异性与敏感性;且其作为单一检测原，与爱德士试剂盒中以副结核菌素为检测原相比，具有更高的特异性。
以MAP0862蛋白作为刺激原通过皮肤变态反应和IFN-γ释放试验对临床样品进行检测，结果显示，在皮肤变态反应中，MAP0862蛋白与副结核菌素作为刺激原的检测结果的符合率为82.00%;在IFN-γ释放试验中，MAP0862蛋白与副结核菌素作为刺激原的检测结果的符合率为68.63%。但MAP0862蛋白在两种方法的检测中有更高的符合率，表明MAP0862蛋白在副结核病的早期检测中有更高的特异性，但其敏感性较低。
本研究结果表明，MAP0862蛋白在副结核病的抗体ELISA检测中具有较好的特异性与敏感性，可用于副结核病的血清学抗体检测。根据这一结果推测MAP0862蛋白主要在以体液免疫为主的副结核病感染中后期参与副结核病感染。本研究为副结核病诊断方法的研究提供了借鉴依据与研究方向，有利于副结核病诊断方法研究的进一步开展。
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