摘要：根据禽流感病毒的基质蛋白（M）基因序列和H5亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因设计并合成了三对特异性引物，用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鉴定方法。试验证明，建立的多重PCR方法可以将H5N1与H6N2、H9N2有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性，适合在基层动物防疫和监督部门进行H5N1禽流感病毒核酸的检测。
关键词：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；检测
中图分类号：S854.43 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）04-0005-03
高致病性禽流感是一种严重危害养禽业发展的烈性传染病，被OIE列为必须通报的传染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，AIV除了可感染禽类外，部分亚型还可感染人、猪、马等。AIV基因组由包括基质蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因在内的8个负链单股RNA片断组成，其中M基因组序列高度保守，HA基因组变异性最强，NA基因组变异次之。HA基因和NA基因某些位点的变异可导致不同的HA亚型和NA亚型[1]，目前发现AIV有16个HA亚型和10个NA亚型，其中H5、H7亚型常表现为高致病性，除了给养禽业带来严重经济损失外[2]，还可感染人，甚至导致死亡[3]。目前，病毒分离、血清学试验仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法，但病毒分离不仅操作繁琐、复杂和耗时，难以对AI进行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。PCR方法是一种基因体外扩增技术，可以在数小时内对某片断基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏感性高、检测快速等特点，已广泛应用于生物学、医学、兽医学的各个领域。多重分型PCR是一种特殊PCR形式，其最突出的特点是一次反应可以达到既分型又能够鉴定亚型的目的，在A、B、C三种流感及其他病源混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值[4，5]。根据RT-PCR技术的原理，研究建立了鉴定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技术。
1 材料与方法
1.1 试验用材料
AIV H5N1抗原，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）和传染性支气管炎病毒（IBV），本室留存。
1.2 生化试剂
Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，内含Mg2+）、RNA酶抑制剂、反转录酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取液购自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亚砜购自上海生工生物工程有限公司。
1.3 引物设计及合成
参考基因库中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，经Clustalx序列软件比对后，选择在保守区域用Primer Primer5.0软件设计了3对引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4 病毒RNA的提取
（1）1.5 mL离心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL样品，混匀，室温放置5 min。
（2）加入120 μL -20℃预冷的氯仿，混匀，室温放置3 min。
（3）12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，取上清120 μL于另一离心管中，加120 μL -20℃预冷异丙醇，室温放置5 min。
（4）12 000 r/min， 4 ℃离心10 min，弃上清，加入600 μL -20 ℃预冷75%乙醇，上下颠倒，12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，弃上清。室温放置约3 min近干燥。
（5）加20 μL 0.1% DEPC处理过的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存备用。
1.5多重RT-PCR
采用总体积为50 μL的多重PCR反应体系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反转录酶（AMV）1 μL，二甲基亚砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC处理过的水补足至50 μL。振荡离心混匀后，在PCR仪上设定程序进行扩增，通过对反转录条件及多重PCR变性、退火、延伸的温度和时间以及循环次数等的优化，最终确定其反应参数为50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min后，进入94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循环35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃结束多重PCR扩增。
1.6 PCR产物分析
取7 μL多重PCR产物与2 μL Loading Buffer上样缓冲液混合，在1.5%琼脂糖凝胶上以100 V电压进行电泳28 min，然后置数码凝胶系统观察拍照，分析记录结果。
回收、纯化229、380、878 bp的cDNA扩增片段，送上海生工生物工程有限公司进行测序，并用DNAStar基因分析软件分析测序结果。
1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性试验
用建立的多重RT-PCR 反应体系对10倍系列稀释的禽流感H5N1抗原进行检测，检验该体系对各稀释度抗原模板的敏感度。
1.8 委托样本的检测
用建立的多重RT-PCR 反应体系对5份已知AIV H9样本、1份已知AIV H6样本和360份禽咽肛拭子盲样进行检测，与出口检疫正式采用的荧光RT-PCR检测方法比较。
2 结果
2.1 多重RT-PCR特异性试验
经多重RT-PCR扩增，其产物与DNA分子量标准比较，显示H5N1抗原扩增出380、878、229 bp3条带，而H6N2、H9N2病毒仅扩增出M1cDNA1条带，NDV、IBV、EDSV则无条带呈阴性，与理论预期值一致（图1）。
2.2H5N1多重RT-PCR敏感性试验
对禽流感H5抗原做HA试验，病毒滴度为1：256。抗原分别做10倍系列稀释，10-1、10-2、10-3倍抗原稀释液多重RT-PCR检测结果阳性；抗原做10-4及以上倍数稀释，多重RT-PCR检测结果阴性。敏感度试验表明，多重RT-PCR 对抗原的最低检测稀释度为10-3，是一种较为灵敏的检测方法（图2）。
2.3 委托样本的检测
5份已知AIV H9样本、1份已知AIV H6样本检测结果显示，仅扩增出229 bp M1cDNA1条带，360份禽咽肛拭子样本则无条带呈阴性，与荧光RT-PCR 方法检测结果一致，符合率达100%，说明该多重RT-PCR方法可以用于基层动物防疫和监督部门的检测。
3 讨论
AIV H5亚型不仅感染家禽，引起大批死亡，造成严重的经济损失，还可感染其他动物和人，有重要的公共卫生意义。传统的病毒分离和血清学试验无法对流行的AIV亚型进行快速检测鉴别。本试验根据AIV 基因易变异的特性及多重分型PCR引物设计原则，参考基因库中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分别针对H5、N1和M1基因设计了3对特异性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1为分别针对H5、N1亚型的特异性引物，能够分别特异性地检测相对应的亚型。利用这3对引物，通过对多重RT-PCR扩增条件的优化，建立了快速检测鉴定AIV H5亚型的多重RT-PCR分型技术。
该多重RT-PCR分型方法检测结果显示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同时出现3条cDNA扩增带，而H6N2、H9N2病毒仅扩增出M1 cDNA 1条带，传染性支气管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和减蛋综合征病毒则呈阴性。多重RT-PCR 敏感性试验结果表明，H5N1抗原最低检测稀释度为10-3。H5亚型特异性试验结果表明，仅H5呈阳性，其他H6、H9亚型和NDV、IBV、EDSV均呈阴性。对所扩增片段进行回收、纯化并测序，其测序结果经DNAStar基因分析软件分析，这些片段分别与AIV HA基因、NA基因和M基因有着高度同源性，提示这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源一致，即分别来源于AIV的H5亚型HA基因、NA基因和M基因，表明该多重RT-PCR分型方法具有高度特异性。
同时，该多重RT-PCR分型法不需要进行多次PCR扩增，在数小时内就可完成对AIV H5亚型的快速检测鉴别，能够在分型同时一步鉴定到亚型，达到快速诊断和鉴别AIV的双重目的，对及时有效控制AIV感染有重要意义，对AIV H5亚型感染制定有效的防制措施具有实用价值和指导意义。
参考文献：
[1] SENNE D A， PANIGRAHY B， kAWAOKA Y， et al. Survey of the hemagglutinin（HA） cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses： amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential[J]. Avian Dis， 1996， 40：425-437.
[2] ALEXANDER D J.A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol， 2000， 74：3-13.
[3] HIEN T T， LIEM NT， DUNG NT， et al. Avian influenza A（H5N1） in 10 patients in Vietnam[J]. NEngl JMed， 2004， 350：1179-1188.
[4] PANG Y， WANG H， GIRSHICK T， et al. Development and application of a multiplex polymerase chain reaction for avian respiratory [J].Avian Dis， 2002， 46（3）：691-699.
[5] 赵建梅， 魏 荣， 王志亮， 等. 一步法多重RT-PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究[J].中国动物检疫， 2003，20（1）：22-24.
