【中图分类号】R521 【文献标识码】A 【文章编号】1003-8183（2013）11-0088-03
由于感染结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）而导致的结核病（tuberculosis，TB）在全世界范围内仍是严重威胁人民生命和健康的公共卫生问题，2011年底世界卫生组织公布2010年全球新发结核病患者约880万例，每年全球死于结核病的人数均有逾百万之巨，在全球感染性疾病导致死亡人数中位居第二。我国每年约有25万余人死于结核病，是其他传染病导致死亡人数的总和的两倍，20世纪90年代后结核杆菌耐药性的出现更使全球的结核病疫情呈回升的趋势。
结核分枝杆菌生长缓慢，无运动能力，其最快分裂增殖速度为18小时一代，而大多数细菌都是几分钟或几十分钟便繁殖一代，结核分枝杆菌易产生耐药性，其耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药），多重耐药性的产生主要可能是由于后者所导致。 结核分枝杆菌的生物学特性导致其检验方法的局限性，目前用于检测结核分枝杆菌及耐药菌株的方法有很多，但大部分都存在灵敏度低、需时较长的缺陷，无法满足现代临床及时快速诊治的需求，因此如何快速、准确的检测结核杆菌，尤其是对现代分子生物学的迅猛发展，以及对结核分支杆菌分子遗传学的深入研究，催生了一系列新的检验技术在结核杆菌临床检测中的应用，本文将就近年来国内外在结核分枝杆菌及耐药菌株的临床检测方面的有关研究做简要综述。
1 细菌学检测方法
细菌培养法对结核分枝杆菌进行分离、鉴定和药物敏感性试验。结核杆菌的培养在结核病的诊断、流行病学指标、分型鉴定、药敏试验、结核病药物的研究等方面依然是不可替代。目前最主要使用的分离鉴别培养基有改良罗氏培养基、L-J培养基、Middle brook 系列培养基等。
1.1 全自动分支杆菌检测系统（BACTEC）
由BD公司研发的全自动分支杆菌培养鉴定仪，BACTEC检测系统是以Middle brood 系列培养基为基础，该系列培养基是国外最常用于结核杆菌研究和诊断目的的培养基之一，具有培养基成分多、配制复杂[2]，但培养时间短的特点。早期的BACTEC检测系统如BACTEC 460TM TB，是通过在培养基中加入标记14C的棕榈酸，当有分枝杆菌生长时，细菌的代谢产生有放射性14CO2，然后由配套的放射信号监测系统检测其含量，非常敏感，但因存在易污染、放射性危害等缺点已逐渐被淘汰。BD公司新推出的无放射性污染的BACTEC 9000MB及BACTEC MGIT 960，其中BACTEC MGIT 960是以Middle brood 7H9培养基为基础，加入BBL PANTA TM抗菌剂和OADC营养剂，并采用荧光物质作为分枝杆菌生长指示剂，指示剂在有氧条件下发生荧光淬灭，当培养基中分枝杆菌生长逐渐消耗氧时，指示剂发出橙色荧光，可通过紫外线透射仪观察，故也称为分枝杆菌生长指示管法（mycobacteria growth
indicator tube，MGIT），是目前最快的分枝杆菌培养、鉴定、药敏系统，平均检出时间为14.4天，最快10天[3-5]，阳性率为82.5%-94%[6]适用于多种标本来源，对各种分枝杆菌检测都适用。但价格昂贵，目前绝大多数基层医疗机构不具备开展该技术的条件。
1.2 变色液体培养基快速检测法
变色液体培养基的主要成分包括磷酸盐缓冲液、谷氨酸钠、多种维生素、微量元素、甘油、马血清、变色剂、甲氧苄氨嘧啶、氨苄青霉素、多粘霉素B、两性霉素B、萘啶酸等，营养丰富，液体培养基更有利于细菌生长，当有活得分支杆菌生长消耗培养基中的氧，再通过分支杆菌氧化还原系统使培养基中的无色噻唑兰还原成红色或紫红色不溶于水的物质，并以颗粒形式分泌至细胞表面，其他细菌及真菌受前处理或抗生素的作用，不能在培养基中生长，培养基不发生颜色的变化。实验表明变色液体培养基法与L-J培养法相比较，L-J培养基细菌生长天数平均为26d，变色液体培养基平均为10d，变色液体培养基测定药敏试验结果时间为2-6d，L-J培养基为28d左右[7]。变色液体培养基具有简便、快速、经济实用的特点且不需特殊仪器，适合基层结核菌实验室的分离、鉴定培养和耐药性试验，但也有其局限性：阳性率依靠标本中分枝杆菌的数量、标本的收集方法及病人的因素，如正在使用抗分枝杆菌药物的治疗等；前处理方法只能用2%-4%的NALC-NaOH消化；部分分枝杆菌产生颜色变化后，长时间继续培养有褪色现象。
2 免疫学检测方法
结核病患者存在细胞免疫与体液免疫分离的现象，即细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫随病情加重而增强，结核菌还具有抗原性较弱且属间和种间有共同抗原决定簇的存在，故目前已商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，因而制约了结核分枝杆菌的免疫学检测方法的发展。目前临床诊断使用较多的免疫学检测方法有酶联免疫吸附法（ELISA法）、结明实验、ICT-TB卡、免疫胶体金标记技术（ICS）、重氮乳凝法等，其中ICT-TB卡是一种免疫色谱法，一次实验中同时检测血清标本中的5种特异性抗体，与其他血清学检测方法不同，弥补了病人体液免疫反应的差异性，具有较高的特异性，操作简单、快速，无需任何设备，尤其适用于对门诊患者做出快速诊断[8，9]。其他方法的缺陷性在于：ELISA法存在观察对象不同，使用的检测抗原不同、难于进行有效的质量控制的问题，容易影响实验结果，导致最终结果出现较大的差异；结明实验虽然特异性、敏感性都较高，标本的采集也方便，但假阳性高，在实际的临床诊断中还应结合其他实验依据进行综合判断；ICS法适用于活动性结核病、涂片培养阴性而有临床症状者以及肺癌与其他肺部疾患的甄别诊断，但检验成本较高
3 分子生物学相关技术
分子生物学的飞速发展为结核分枝杆菌的快速检测创造了可能性，传统检测方法都存在着特异性差、灵敏度低、操作复杂、耗时长等不足，而利用PCR的方式进行结核分枝杆菌检测的特异度在80%-100%之间，灵敏度在70%-100%之间[10]，都有远远高于细菌培养和抗酸染色，并且可直接检测临床标本，缩短检测时间，实现结核病的早期诊断。随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成和耐药分子机制的逐步明确，分子生物学检测技术在耐药性的检测上优势更为凸显。
3.1 PCR
至1989年Hance首次运用PCR的方法检测结核杆菌DNA起，PCR已在临床上受到广泛应用。主要依据结核分枝杆菌重复序列、蛋白质编码基因或16SrRNA等高度保守基因设计的特异引物，通过PCR简便、快速、灵敏、特异地从多种临床标本中检测出结核分枝杆菌DNA，只需1天左右的时间，但不能鉴别活菌和死菌，在检测过程中还应注意假阳性和假阴性问题。
3.2转录介导扩增反应即基因探针扩增直接实验
转录介导扩增反应即基因探针扩增直接实验（AMTDT）是由美国加州Gen-Probe公司发展起来的由DNA介导的等温rRNA扩增法，是一种恒温扩增方法，无温度循环，不需要PCR扩增仪，检测的灵敏度与常规PCR相当，扩增子应用吖啶酯（acridinum ester， AE）标记的化学发光探针（AE-DNA探针）进行核酸杂交保护实验（hybridization protection assay， HPA），通过照度计检测杂交探针的相对发光值（ralative light units， RLU），以RLU≥3×104判断为阳性。该rRNA序列在核酸中存在2×103拷贝数，应用AMTDT可使特异性靶rRNA序列扩增109倍，最低检出限为每毫升10个，标本处理后3.5h即可获得结果。
3.3 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR），利用DNA聚合酶具有从5"→3"水解DNA链的特性，通过合成一段含有荧光基团和淬灭基团的DNA探针，在PCR反应过程中探针被降解释放出荧光信号，随着反应循环的进行实时检测反应体系中的荧光信号，将样本中的信号强度与标准样品相比较，可计算出待测样本中的模板DNA的浓度，常见的有荧光探针和SYBR Green 两种方法，SYBR Green 是一种双链DNA结合染料，它结合到DNA分子上后，可以使其荧光强度增加1000倍以上，而未结合DNA分子的染料不发射荧光信号，保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，而且不需设计探针[11]，目前使用较多。实时荧光定量PCR不仅灵敏度高、特异性强、可以直接对痰液标本进行检测，密闭的系统减少了体系本身及对实验室环境的污染，市面上成熟的试剂盒也较多，临床上应用广泛，是目前临床诊断结核病的主要手段之一。
3.4 PCR-SSCP
PCR-SSCP（polymerase chain reaction-singlestranded conformation polymorphism）聚合酶链反应-单链构象多态性。该方法是基于不同单链DNA分子的碱基序列不同（甚至
单个碱基发生变化）将形成不同的空间构象，从而导致其在非变性凝胶中的泳动速度发生改变。将PCR扩增产物变性成两条单链，用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，不同空间构象的DNA片段具有不同的迁移率，在凝胶上显现出不同的带型，通过与标准参考菌株的带型比较，从而检测待测样品是否发生基因突变，在结核分枝杆菌的耐药性快速检测中应用广泛[12]。PCR-SSCP快速、灵敏、特异性高，可在2天内出结果，能直接用于痰标本中结核分支杆菌耐药性的检测，但存在只能确定有无基因突变而不能确定突变的位点和性质，操作技术要求较高等缺陷。
3.5 PCR-RFLP
PCR-RFLP（限制性片段长度多态性）是将 PCR分类鉴定技术和限制性内切酶分析技术相结合的新技术。通过PCR扩增结核分枝杆菌基因组中含有特定酶切位点的DNA片段，再将PCR产物经限制性内切酶（最常用的内切酶是PvuⅡ，其次是BstEⅡ、BamHI等）消化，琼脂糖电泳分析。不同分枝杆菌酶切消化后产生的DNA片段数量或者大小不同，因而电泳图谱呈现多态性，是鉴定分枝杆菌和检测耐药性的重要方法，常用于异烟肼耐药位点katG315位点和乙胺丁醇embB306位点突变的快速检测。特异较高，但只能得知存在突变不能确定突变的性质。
3.6 多列探针技术
多列探针技术（line probe assay， LiPA），又称线性探针杂交技术。是根据反向杂交原理设计。用带有生物素标记的引物对靶序列进行PCR扩增，扩增产物与膜固定再与捕获探针杂交，加入交联碱性磷酸酶的链霉亲和素，通过酶免疫显色法显示结果，由此来检测靶DNA是否变异，该方法简便，快速，5.5-24 h可获得结果，可信度高，但是受膜上探针的限制，不能检测出所有的突变类型。通过杂交信号而获得序列信息，与基因芯片技术有异曲同工之处。但LiPA技术相对基因芯片在制作过程中过仪器要求不高，比基因芯片的应用范围更加广泛。LiPA技术不仅可以用于病原微生物耐药基因的检测[13]而且还用于分型检测[14]。基于LiPA原理，开发出的用于检测耐药性基因突变的商业化诊断试剂盒主要有Geno Type MTBDR plus和INNO-LiPA Rif.TB两种，INNO-LiPA Rif.TB是针对rpoB基因，Geno Type MTBDR plus主要针对rpoB和katG、inhA3种基因可以同时检测利福平和异烟肼的耐药性。MTBDR plus检测利福平的敏感性和特异性分别为96.9%和93.2%，检测异烟肼的敏感性和特异性为85.3%和98.1%[15]
3.7 基因芯片
基因芯片技术始于本世纪90年代，其原理是将多种探针固定在基片上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。由于该法同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对大量样品进行检测和分析，基因芯片可用于检测结核分枝杆菌4条基因11个位点的30种单核苷酸多态性，用该方法准确、快速，特异性高，信息量大，从样品制备到检测结果仅需4h，可准确地确定突变位点和突变类型，这些都是目前为止其他检测技术无法达到的，但芯片制备比较复杂，样品准备与标记也比较繁琐，检测成本较高，所需仪器也比较昂贵，目前主要应用还在科研院所和大型医疗机构。
参考文献
[1] WHO global report on antituberculosis drug resistance：Eastern Europe and Central Asia Key areas[s].Eurosurveillance，2004，8（12）：2419.
[2] 张敦熔.现代结核病学.北京：人民军医出版社，2000，17-19.
[3] Hanna BA， Ebrahimzadeh A， Elliott LB， et al. Multicenter evaluation of the BACTEC MGIT 960 system for recovery of mycobacteria. J Clin Microbiol，1999，37（3）：748-752.
[4] Chien HP， Yu MC， Wu MH， et al. Comparison of the BACTEC MGIT 960 with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens. Int J Tuberc Lung Dis，2000， 4（9）：866-870.
[5] kos Somoskvi， Csaba Kdmn， kos Lantos， et al. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 System， the BACTEC
460 TB System， and Lowenstein-Jensen medium. J Clin Microbiol，2000，38（6）：2395-2397.
[6] Katila ML，Katila P，Erkinjuntti-Pekkanen R.Accelerated detection and identification of mycobacteria with MGIT960 and COBAS AMPLICOR systems，J Clin Micobiol，2000，38：960-964
[7] 韩琴.变色液体培养基快速检测结核分枝杆菌及耐药性[J].医学理论与实践，2010，23（12）：1500-1501.
[8] 刘志辉.ICT-TB卡快速检测结核抗体的临床价值.中国医师杂志，2000，（3）：147-148
[9] 高孟秋，田苗.不同结核分支杆菌抗原对结核病的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，1999，22（10）：613-615.
[10] 杨伟洪，陈罡.PCR检测结核杆菌的优越性及局限性分析.国际医药卫生导报，2006，12（10）：141-144.
[11] Simpson D A， Feeney S， Boyle C， et al. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR Green Ⅰ fluorescence： a versatile approach to quantitative PCR[J].Mol Vis，2000（6）：178-183.
[12] Pozzi G，Meloni M ，Zona E，eta1.rpoB mutation in mulidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy.J Clin Microbial，1999，37：l197
[13] Federico G，Elisabetta I，Federica S，et al.Evaluation of a new line probe assay for rapid identification of gry mutations in mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother，2005，7，2928-2933
[14] Bernhard k，Leen-Jan D，Lianne S，et al. Development and Clinical Evaluation of a Highly Sensitive PCR-Reverse Hybridization Line Probe Assay for Detection and Identification of Anogenital Human Papillomavirus. Journal of Clinical microbiology，1999，8，2508-2517
[15] 菅记涌，王嫩寒.MTBDR plus方法快速检测北京地区临床结核分支杆菌分离利福平和异烟肼耐药性效果评价.中国防痨杂志，2010，10（32）：611-614
