摘 要 蛋白质芯片技术是一种快速、高效、高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。目前,它已成为肿瘤蛋白质组学研究的重要工具之一。它能洞察肿瘤细胞、组织和生物体蛋白质含量的细微变化，且能精确分析某一特定蛋白质的理化性质。就近年来蛋白质芯片的发展及其在肿瘤蛋白质组学研究中的应用做了简要的叙述，提出了该技术存在的问题，并对其发展前景进行了展望。
关键词 蛋白质芯片 蛋白质组学 肿瘤
中图分类号 Q-49文献标识码 E
人类基因组计划（human genomic project, HGP）的完成，极大推动了功能基因组研究的发展和后基因组时代的到来。但基因数量有限性和结构相对稳定性与生命现象复杂性和多变性之间的巨大反差，使人们的目光逐渐从基因组学转向蛋白质组学，作为生命活动执行者，基因组编码的所有蛋白质随之成为研究热点。其中肿瘤蛋白质组学是从细胞整体水平上认识在肿瘤的发生、发展过程中蛋白表达谱的变化。为了达到这个目的，就需要高通量、快速简便的技术平台支持。而传统的蛋白质组学研究方法——二维凝胶电泳和酵母双杂交技术等往往操作烦琐，结果具有不确定性，且所需费用高。因此，人们发展了一种蛋白质组学研究新技术——蛋白质芯片。
1 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，它是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针作为配基以预先设计的方式固定在玻片、硅片或纤维膜等固定载体上组成密集的阵列，能够高通量地测定蛋白质的生物活性、蛋白质与大分子和小分子的相互作用，或者用于高通量定性和定量检测蛋白质。
1.1 蛋白质芯片的分类及特点
根据芯片表面修饰的不同可分为：化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片又可分为疏水、亲水、弱阳离子交换、强阴离子交换、金属离子鳌合等。这些芯片可以根据蛋白质的化学特性如疏水或亲水性及所带电荷而选择性地捕获特异蛋白质。而生物表面芯片可分为抗原－抗体、受体－配体、DNA－蛋白质、酶等芯片，其原理是抗原、抗体结合或供体、受体结合从而分离某一特异性蛋白质。
蛋白质芯片特点：① 可直接用粗生物样品进行分析，如血清、尿、体液等；② 灵敏度高，只需0.5~5 μL样品，或2 000个细胞即可检测；③ 特异性高，并可定量；④ 高通量，操作自动化；⑤ 可同时快速发现多个生物标记物；⑥ 可发现低丰度、小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质，特别是膜蛋白质。
1.2 蛋白质芯片技术的作用原理
蛋白质芯片技术主要包括4个基本要点：芯片阵列的构建、样品的制备、芯片生化反应、信号检测及分析。首先按设计好的阵列方式将蛋白质分子点印在介质上，将用荧光标记的样品蛋白质与芯片反应，通过激光共聚焦显微镜和CCD照相机对荧光信号进行扫描分析，得出检测结果。蛋白质芯片的核心技术是芯片的制备和反应信号的检测分析。由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式，因此对芯片的表面修饰非常重要，要保证蛋白质稳定地固定在片基上而又不失生物活性。
1.3 SELDI－TOF-MS技术
为使操作进一步快捷方便，在同一系统中集分离、纯化、鉴定、检测和数据分析为一体。如今，蛋白质芯片常与芯片阅读器和分析软件结合使用，从而形成了“表面加强激光解析电离化飞行时间质谱”蛋白质芯片技术。其中芯片阅读器是激光解析电离飞行时间质谱仪，它通过激光脉冲辐射将样品转化为运动的气态离子并按质荷（M/Z）大小进行分离，根据不同质荷比在电场中飞行时间长短不一，从而绘制出一张质谱图。分析软件，用来处理实验所得的数据，通过对已知数据进行差异性分析，从而发现有鉴别意义的峰值变化。
2 肿瘤蛋白组学的概念和研究内容
1994年澳大利亚的威克斯首先提出了蛋白质组的概念：即基因组所表达的全部蛋白质。它有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，从机体或细胞的整体水平上来阐明生物体全部蛋白质的表达、修饰、结构功能和相互作用。因此产生了一个新的研究领域——蛋白质组学。其中肿瘤蛋白质组学主要是比较分析肿瘤组织细胞与正常的组织细胞、肿瘤在不同发展时期的细胞内整体蛋白质的差异，获得肿瘤异质性的信息。肿瘤蛋白质组学研究的主要内容有：建立各种肿瘤的蛋白质组数据库；寻找肿瘤相关蛋白质，分析肿瘤相关蛋白质的结构和功能，鉴定出肿瘤标志物，进而为肿瘤诊断、治疗、预防以及发病机制的研究提供新的依据。
3 蛋白质芯片技术在肿瘤蛋白质组学研究中的应用
3.1 筛选肿瘤标志物
蛋白质芯片在此领域中进展最快，这是由于其对高通量的样品处理是快速、敏感、批量的，这些特征使得蛋白质芯片技术适合从恶变前的病灶来研究肿瘤的进展，而这时微量的、多个的蛋白质的变化可能已具有病理诊断意义。
3.1.1 消化系统肿瘤
3.1.1.1 食管腺癌
通过造模结合蛋白质芯片技术研究食管腺癌蛋白表达，发现糖调控蛋白94（Grp94）高度表达，而食管腺癌中则没有这种现象，在人体组织标本中也有相同结果。
3.1.1.2 胃癌
应用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术筛查不同时期胃癌血清蛋白图谱，其特异性与敏感性都相当突出。
3.1.1.3 肝癌
应用SELDI-TOF-MS技术研究肝癌患者、肝硬化及正常人血清的蛋白质谱，并建立一个肝癌蛋白质谱图以检测随机标本，其敏感性达到88.2%，特异性达94.6%；相对于传统的诊断方法，SELDI-TOF-MS技术具有更高的特异性及各级敏感性。对82例肝硬化患者(其中44例伴有原发性肝癌)血清蛋白进行分析表明，6组蛋白质高峰可用以鉴别有无肝癌，其准确率达92.5%，其中8 900 Da最具鉴别力。利用金属亲和蛋白质芯片技术研究相关性疾病的蛋白质图谱，以判断病变阶段，区分正常肝组织、慢性丙肝病毒性肝炎与原发性肝癌，其特异性及敏感性为74%~95%。联合检测AFP、异常凝血酶原和GP73检测原发性肝癌可使敏感性及特异性分别提高到75%、92%。
3.1.1.4 胰腺癌
用蛋白质芯片技术和SELDI-TOF-MS对来自胰腺癌患者和非胰腺癌患者的胰液进行分析，发现15例胰腺癌患者中10例样品中有分子量为16 570 Da的蛋白表达，而7例非胰腺癌患者中只有1例出现此蛋白的表达，阳性率仅为17%。经免疫测定发现这种蛋白为HIP/PAP-1，经量化表明HIP/PAP-1在胰腺癌患者胰液和血清中的表达量远远高于对照组，因此胰液中的HIP/PAP-1可作为胰腺癌诊断的标志物。
3.1.1.5 结肠癌
通过对良性肠病、恶性和结肠癌前病变患者的血清与健康对照组样品比较，发现了一种相对分子质量为13.8 K的特殊相关蛋白质，在结肠癌及其癌前病变中表达，而在非癌或克罗恩病及溃疡性结肠炎等良性肠病中不表达。因此，通过检测血中是否存在这些蛋白，可确定出肠病的良恶性，并对结肠癌作出早期筛查。
3.1.1.6 大肠癌
偌博兹等采用SELDI-TOF-MS选择疏水性芯片（H4）分析了大肠癌患者与正常对照血清蛋白图谱之间的差异，其中相对分子质量为8 942 Da的蛋白在大肠癌患者中高表达，而9 300 Da的蛋白呈低表达，正常对照组上述2个蛋白的表达情况与患者组相反。
3.1.2 生殖系统肿瘤
3.1.2.1 前列腺癌
应用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术对167例前列腺癌、77例良性前列腺增生患者以及82例正常对照的血清标本进行了检测，并严格按照直肠指诊阴性和小于4 ng/mL的条件挑选对照，并以年龄将对照与阳性病例相配对。检测时联合应用了多种芯片，包括H4、WC、IMAC等，其中IMAC-Cu-3蛋白质芯片的检测效果最为理想。结果发现9个前列腺癌相对特异标记物，用分类决策树软件进行分析，使之与良性前列腺增生病例、正常人群鉴别，敏感性为83%、特异性为97%、准确性为96%，试验组和总体人群的阳性预测值分别为96%和91%。
3.1.2.2 卵巢癌
用4种蛋白芯片（H4、WCX2、SAX2、IMAC-3-Cu）检测了58例卵巢癌患者、50例正常对照者血清，其中在IMAC-3-Cu芯片上检测到一相对分子质量为11 700的蛋白，经离子捕获同步质谱测序，证实为珠蛋白A链。阿德卡尼等认为卵巢内发生的病理变化能够在血浆中的生物标记物中得以反映，他们联合运用SELDI质谱分析和基于人工智能的信息法则系统，在血浆中发现了很少量的能区别正常人群和卵巢癌病人的关键蛋白质。用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康妇女和50例卵巢癌患者，图谱采用534、989、2 111、2 251、2 465质荷比（M/Z）蛋白峰综合分析，灵敏度100%、特异性95%、预测准确率94%，同样的标本用CA125预测准确率只有35%。
3.1.2.3 乳腺癌
相关研究应用SELDI技术IMAC-Ni芯片筛查169份血清样品，其中包括103名乳腺癌（0期4例，Ⅰ期38例，Ⅱ期37例，Ⅲ期24例），41名健康妇女及25名良性乳腺疾病患者。0～Ⅰ期乳腺癌和非癌对照组中筛选出3个生物标记物来检测所有血清，结果乳腺癌检出敏感性为93%，特异性为91%。研究发现，乳腺癌患者的血清样品中有一个28.3 ku的蛋白质，而且它仅存在乳腺癌患者的样品中。由此，研究者设计出了NMP66试剂盒，用其对可疑患者进行检测，结果发现这一蛋白在乳腺癌的早期诊断（无腋下淋巴结转移）及晚期转移性乳腺癌的诊断上特异性达到了100%，在排除非恶性肿瘤个体上的特异性达96%，远远高于临床应用的其他检测手段。
3.1.3 泌尿系统肿瘤
3.1.3.1 膀胱癌
阿达姆等应用SELDI蛋白芯片系统进行膀胱肿瘤的诊断研究，总共取185份尿样，95份取自可转移性膀胱癌患者，52份取自非癌性尿路疾病患者，35份取自正常个体，蛋白芯片检测后获得图谱中有16个较为有意义的蛋白波峰，可用于疾病分类，预测准确率达77%，灵敏度79%，特异性81%。
3.1.3.2 肾癌
由于肾脏位置较隐蔽，早期常无明显临床症状，且缺乏临床可实用的肾癌诊断、监测用标记物，极易延误诊断，因此寻找肾癌相对特异性肿瘤标志物更有必要。科学家用SELDI技术结合蛋白质芯片研究8例肾细胞癌（RCC）组织（包括正常组织、外周癌组织和中心癌组织），4例子宫颈上皮细胞瘤组织，3例子宫颈癌组织。用H4芯片发现RCC组织过度表达1 1951.2 Da及12 019.9 Da蛋白质。用SAX2芯片发现RCC组织过度表达12 027 Da蛋白质，但低表达10 205 Da、10 953 Da及12 738 Da蛋白质，从而为RCC病人的检测提供方法。
3.1.4 呼吸系统肿瘤
3.1.4.1 喉癌
肖雪媛等采用蛋白质芯片技术对33例喉癌(12例声门癌，18例声门上癌，3例声门下癌)病人血清和31例正常人血清进行了检测。结果显示与正常人血清蛋白质谱相比，喉癌病人血清中有16个差异蛋白，其中8个标志分子在病人血清中高表达，8个标志分子在病人血清中低表达。Biomarker Pattern软件在设定条件下自动选取上述标志分子中的2个蛋白质（8 153 Da和2 035 Da）用于建立喉癌诊断的分类树模型。此分类树具有2层3个叶结点，可将96.9%的喉癌病人和96.7%的正常人正确划分出来。
3.1.4.2 肺癌
北京师范大学蛋白质组学中心何大澄教授用SELDI技术从30名患者和相应数量的健康人血样品中成功筛选出15个肺癌标志分子，为肺癌诊断技术的发展提供了关键性的基础，将大大改变我国目前所有对肺癌临床检测手段都要待病灶形成后才能检测出来的状况，能够在人体甚至细胞未出现任何病变，仅从蛋白质的变化中即可检测出癌变前兆。
3.2 基础研究
使用蛋白质芯片技术对正常B细胞分泌的蛋白质和EB病毒转化的B细胞分泌的蛋白质进行质谱分析，发现转化后的B细胞系有一过度表达的M/Z为4 972.1的蛋白质峰值，通过逆相层析技术和胰蛋白酶消化，肽段相对应的片段被确认为胸腺素beta-4。
用SELDI蛋白质芯片和二维电泳对头颈部肿瘤培养细胞系的转移相关蛋白进行了研究，通过对头颈部鳞状细胞癌培养细胞系UM-SCC10A和UMSCC10B（前者来自原发部位，而后者来自同一病人转移性淋巴结）的分析发现，在转移性淋巴结培养细胞系中的两种膜相关蛋白（层黏连蛋白和）和糖酵解蛋白A烯醇化酶是上调的，而calumenin前体则是下调的，从而提示蛋白质组学是了解肿瘤发展和演进中不正常分子的重要手段。
在研究肿瘤坏死因子亚家族成员在慢性淋巴细胞白血病的发病机理时发现，用BCMA-Fc阻断BAFF及其受体的结合可以加速白血病淋巴细胞的凋亡，并且白血病淋巴细胞的BAFFmRNA增高，膜上有表达BAFF。据此推测有可溶性的BAFF，但是Western印迹、免疫沉淀等技术却没发现。他们用兔子的BAFF抗体包裹的蛋白质芯片与5份慢性淋巴细胞白血病患者的血清混合，然后用SELDI蛋白质芯片检测，发现一个28 161 Da的单峰，证明是BAFF，而用同样的方法检测5份健康供者的血清却没发现相应的峰值。正是高通量、高敏感的蛋白质芯片的应用使BAFF在慢性淋巴白血病的发病中的作用被认识。这启发科学家探索新的治疗方法，例如给患病者注射BAFF抗体或可溶性的BAFF受体。
4 存在的问题和发展前景
蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强有力的工具，相对于DNA芯片研究的进展速度，蛋白质芯片的研究进展显得相对滞后，主要有以下问题亟待解决：（1） 寻找材料表面的修饰方法；（2） 简化样品制备和标记操作；（3） 增加信号检测的灵敏度，如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白质的检测；（4） 高度集成化样品的制备及检测仪器的研制和开发。这些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度，同时也是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所在。随着技术的不断深入和更加完善，如表面化学修饰技术的进步，可以做到在载体上固定多种活性蛋白质;纳米标记的引入，可提高芯片检测的灵敏度;近期也有望开发出简便可靠的检测系统，这些技术难题将逐渐被解决。
蛋白质芯片提供了一种高通量的蛋白质分析技术，能够进行受体配体检测，多种感染因素筛查和肿瘤的诊断，了解蛋白质同包括药物在内的小分子相互键合的作用，从基因水平上寻找靶目标和靶药物。因此，蛋白质芯片在整个蛋白质组分析以及在多蛋白质表达异常的遗传病诊断、治疗和新的药物发现方面具有广阔的应用前景。
参考文献：
［１］ 荆涛，荆友等．蛋白质组学研究进展及在泌尿系肿瘤研究中的应用[J]．肿瘤研究与临床，2006，（18）：348-351.
［2］ 钟春英，彭蓉，彭建新，洪华珠．蛋白质芯片技术[J]．生物技术通报，2004，（2）：34-37.
