摘 要 近些年来有一项基因工程抗体技术逐渐被发展起来，它就是噬菌体抗体库技术。其原理是在噬菌体载体中插入一段经体外克隆的抗体基因，再将其转染至细菌中表达，最后利用抗原筛选的方法便可以收获具有抗原特异性的单克隆噬菌体抗体。人源性的抗体也可以通过这种技术得到，其优越性体现在病毒感染以及诊断与治疗肿瘤等方面。
关键词 噬菌体展示技术 噬菌体抗体库 筛选
B淋巴细胞杂交瘤技术的创立，成功制备了具有特异性的单克隆抗体（McAb），但是单克隆抗体并不能在人体内进行很好的应用，因为利用杂交瘤技术在制备人源单克隆抗体方面进展有限，同时鼠源单克隆抗体又对人体有免疫原性。而随后出现的基因工程抗体，将鼠单克隆抗体改造成了“人源化”与“小型化”的特性；同时新的单克隆抗体也通过抗体库技术进行了筛选。
我们将B淋巴细胞中的抗体重链可变区（VH）以及抗体轻链可变区（VL）基因利用PCR方法进行扩增，再将其中的Fab片段或者单链抗体（scFv）片段展示在噬菌体表面，这就使得抗体基因存在于噬菌体基因中，抗体分子也表达在噬菌体表面，这就是噬菌体基因与蛋白的统一。此时我们就可以利用抗原与噬菌体表面抗体的特异性结合而筛选出所需的抗体并进行抗体扩增了。这项生物技术为人源单克隆抗体的制备提供了可能，具有不可估量的作用。
1.技术原理
抗体分子Fab片段或ScFv片段与单链噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，即构成了噬菌体抗体。噬菌体抗体不仅能够与抗原进行识别及结合，还能够在宿主菌中进行增值。噬菌体抗体与靶抗原进行亲和吸附—洗脱—扩增等步骤后即可获得靶抗原的配体肽链。为了获得高亲和力的噬菌体抗体，我们可以通过突变以及链置换的方法进行改进。
2.噬菌体抗体库的构建与分类
构建噬菌体抗体库过程如下：首先对脾脏等组织中的B淋巴细胞进行分离，提取其中的mRNA，反转录后形成cDNA；然后根据不同抗体库的建立，以相应的VH和VL引物作为扩增相应的抗体基因片段的先决条件；再次将抗体基因片段插入到噬菌体载体中，以丝状噬菌体和噬菌粒为常用载体；最后将其转化至细菌中进行抗体库的构建。抗体库通过与靶抗原几轮的亲和吸附—洗脱—扩增过程将获得特异性噬菌体单抗克隆。
3.噬菌体抗体库的筛选方法
3.1经典的筛选技术
将纯化后的抗原包被在酶标板等固相介质中，再向固相介质中投入待筛选的噬菌体抗体库，值得注意的是在包被抗原过后要加入脱脂乳对未被抗原占据的位点进行封闭，以免噬菌体抗体与固相介质结合。接下来洗去未与抗原结合的噬菌体抗体，最后用碱性溶液或酸性溶液将与抗原亲和性较高的噬菌体抗体洗脱下来。将洗脱下来的噬菌体抗体感染宿主菌进行扩增后进入下一轮筛选[1]。
3.2筛选效率的影响因素
影响筛选效率的因素主要有以下三个方面：噬菌体的种类、靶抗原的密度或浓度以及清洗时间。不同种类的噬菌体在筛选过程中呈现出不规律性，但是另外两个因素则决定了噬菌体筛选的严紧度。随着抗原密度或浓度的减小，清洗时间的延长，筛选的严紧度也就越高。不同的噬菌体抗体库容量，选择不同的严紧度进行筛选，可以适当提高筛选效率。一些表达频率较低而亲和性却较高的目标噬菌体在较高的严紧度时可能会被筛去，噬菌体的富集过程在严紧度较低的情况下又会太慢，导致筛选轮数增加，费时费力。所以总结出的经验是在筛选库容量较小的噬菌体抗体库时，为了避免亲和性较高但表达量较低的噬菌体克隆的丢失，要在前几轮筛选中应用中等的严紧度；在筛选库容量较大的噬菌体抗体库时，为了快速富集较高亲和性噬菌体克隆，要采用较高的严紧度较为合适[2]。有时为了得到较高亲和性的噬菌体克隆，我们可以利用添加目标竞争性结合物或抗原竞争性结合物的方法适当提高严紧度。
4.筛选技术的发展
已知的抗原性质以及获得纯化的抗原是传统筛选抗体技术的先决条件。而在以下这些情况下，传统的筛选抗体技术并不能够筛选到合适的抗体，比如：抗原不能纯化、未知的抗原性质以及失活的抗原等等，此时就急需建立一种更合适的筛选系统。越来越多的专家对传统的筛选系统进行了改进，以提高原有的效率。
4.1全细胞筛选
只有靶抗原具有较高的表达量时，才可以利用全细胞来进行筛选，这种方法筛选效率不高，而且亲和性噬菌体丢失严重。因此，Siegel 等人研究发现了磁性细胞分离法（MACS），先将磁珠包裹在抗原阳性的细胞上，然后再与大量的抗原阴性细胞进行混合，随后投入待筛选的噬菌体抗体库，最后用磁柱将与特异性噬菌体结合的抗原阳性细胞进行分离。
将噬菌体抗体库内化进细胞也是一种较为合适的筛选方法。其原理是先将噬菌体抗体库与抗原阴性细胞进行混合，再在37℃条件下将抗原阳性细胞与此噬菌体抗体库孵育 15 min，便可以使噬菌体抗体内化进细胞中去，此时未内化进细胞的非特异性噬菌体可以用酸性洗脱液进行洗脱，再将细胞裂解，此时裂解液中的特异性噬菌体便可感染细菌。由于噬菌体感染细菌的过程会受到酸性洗脱液影响，而细胞内化的方法是在特异性噬菌体进入细胞后才开始用酸性溶液洗脱的，所以不会导致特异性噬菌体抗体的丢失。
4.2切片组织筛选
由于冷冻的组织切片含有较少的抗原量，所以通过这种筛选方法获得的噬菌体含量非常低。
4.3体内筛选
体内的筛选方法也有很多的报道，比如Mutuberria等人在裸鼠体内接种表达有EGF22 阳性的大肠癌细胞系，再将噬菌体抗体库通过尾静脉注入到裸鼠体内，最后分时间段回收裸鼠体内的噬菌体。又比如Johns等人将噬菌体抗体库注入小鼠体内，最终在小鼠胸腺内获得了抗内皮细胞的特异性单链抗体。
5.噬菌体抗体库技术的优势
5.1模拟天然全套抗体库
抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血，骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA，mRNA反转录形成cDNA，这些mRNA是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。
5.2避免使用人工免疫和杂交瘤技术
由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，从而避免了使用人工免疫动物和细胞融合技术。
5.3可获得高亲和力的人源化抗体
在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。
6.噬菌体抗体库技术的应用和前景
6.1研制疫苗和诊断试剂
在诊断疾病与研究疫苗等方面噬菌体抗体发挥着重要的应用价值。首先由Folgori等人提出的将患者阳性血清中的抗体与噬菌体随机肽库进行结合，就可以获得病原特异性的噬菌体模拟肽，这种思路的可行性用乙肝病人的血清进行了证实。与阳性血清特异性结合的噬菌体肽作为免疫原接种动物后得到的抗体，可以与阳性血清抗体有交叉反应，这些都说明了噬菌体肽作为疫苗的成分具有重要的价值。对于一些致病机理不明确的疾病，我们可以利用到肽库技术，即将阳性血清与阴性血清同时与肽库进行反应，就可以筛选出这种疾病的特异性表位。与此同时，重组的噬菌体多肽也可以作为抗原模拟肽，它不但容易制备而且可以解除非特异性的干扰，在疾病的早期诊断中具有重要意义[3，4，5]。
6.2表位研究
表位研究是噬菌体抗体库技术的最初定位。表位即配体表面的一段决定位点，配体的结合特点与折叠状态都由它决定。表位可以是一段连续的氨基酸残基，但是大多数表位却是不连续的氨基酸残基，无论怎样它都含有受体所必需的一些氨基酸，分子之间的相互作用也可以通过表位的研究来了解。利用噬菌体抗体库技术可以简化对于表位研究的这一过程。
6.3 医学基础性研究
噬菌体抗体库技术可以满足蛋白组计划中需求的大量抗体，这是传统单抗体技术难以完成的。噬菌体抗体库可以内化进入细胞，这种过程筛选到的抗体在其介导的治疗功能中意义重大。
6.4在肿瘤体外诊断中的应用
该方法是用从噬菌体抗体库中筛选到的特异性抗体来构建蛋白微点阵，然后利用荧光标记技术对样本进行检测。
6.5在肿瘤诊断中的应用
噬菌体抗体（scfv或Fab）不含有h段且分子量小，更适合用于放射性显影，单链抗体能够明显减少本底，提高组织/血浆放射性比率，单链抗体有很好的显像效果。此外，利用非放射性物质标记的噬菌体抗体对肿瘤的显像亦有报道。
6.6在肿瘤治疗中的应用
单克隆抗体分子量较大.组织穿透性差，使其在肿瘤部位的浓聚减少，这是其治疗效果不甚理想的一个重要原因。同时，人源化的鼠单克隆抗体在人体内仍可诱导人体产生人抗鼠免疫反应，也是可能原因之一。而利用噬菌体抗体库技术生产的scfv或Fab因分子量小，组织穿透性好，在肿瘤部位浓聚快[6]。而全人源的scfv或Fab更是完全避免了人体产生人抗鼠免疫反应。
多种抗体已经通过噬菌体抗体库技术得到了制备，抗半抗原抗体、抗蛋白质抗体以及抗病毒颗粒抗体已经从未经免疫的人源天然抗体库中得到了筛选，其中抗病毒抗体已显示出良好的应用前景。
7.结语
噬菌体抗体库技术已经在生物学领域显示了其重要的应用价值，是开发新型诊断试剂和疫苗、抗原表位鉴定以及疾病诊断和治疗的重要生物技术手段。随着噬菌体抗体库技术在容量和亲和力等方面的不断改进，我们相信该技术在解决生物学研究课题等方面将发挥着越来越重要的作用。
参考文献：
[1] Rohatgi S，Ganju P，Sehgal D. Systematic design and testing of nested（RT-）PCR primers for specific amplication of mouse rearranged / expressed immunoglobulinv ariable region genes from small number of B cells [J]. Journal of Immunological Methods，2008，339（2）：205-219.
[2]毕司英，毛晓燕. 噬菌体抗体库筛选技术研究进展[J]. 微生物学免疫学进展，2012，40（1）.
[3]Ren X，Liu B，Yin J，et al. Phage displayed peptides recognizing porcine aminopeptidase N inhibit transmissible gastroenteritis coronavirus infectionin vitro[J]. Virology，2011，410（2）：299-306.
[4]Ren X，Wang M，Yin J，et al. Phages Harboring Specific Peptides That Recognize the N Protein of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Distinguish the Virus from Other Viruses[J]. J Clin Microbiol，2010，48（5）：1875-1881.
[5]Wu D，Li G，Qin C，et al. Phage Displayed Peptides to Avian H5N1 Virus Distinguished the Virus from Other Viruses[J]. PLoS One，2011，6（8）：e23058.
[6]唐喆伟，韩红辉，杜冰，等. 噬菌体抗体库中筛选抗GST单链抗体及其活性鉴定[J].现代免疫学，2010，30（5）.
