[摘要]致龋性菌斑是龋病发生的始动因子，其形成并生长于口腔这一特殊的生理环境中。因此，对其精密而准确的提取技术是科学研究成功的关键。本文就致龋性菌斑的多种提取技术作一综述。
[关键词]致龋性菌斑；提取技术；进展
[中图分类号]R 781[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.014
Research progress on the techniques of extracting cariogenic plaqueLi Jingwen, Wang Sheng, Hu Tao.（Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）
[Abstract]Cariogenic plaque is the key factor to the occurance of caries, which forms and develops in oral cavity, a special physiological enviroment. Therefore, the precious and accurate technique of extraction is vital for successful research. This article sums up the advantages and disadvantages of various techniques of extracting cariogenic plaque.
[Key words]cariogenic plaque；techniques of extraction；progress
牙菌斑是一种典型的口腔生物膜，是龋病和牙周病的致病因子。科学合理的提取技术能保证牙菌斑完整的生物学形态，能够提高研究的真实性、可靠性。菌斑提取技术可分为体内与体外培养提取2大类，本文将对其作一综述。
1体内提取技术
1.1染色刮取
采集牙菌斑前，令受检者2 h以上不进食并除去口内食物残渣，然后在无菌纱托或纱球吸湿及局部隔湿条件下，用生理盐水冲洗采样部位，进行菌斑染色后用无菌探针刮取牙齿唇颊面的菌斑样本，置于还原液内[1]。这种方法主要应用于即时评估牙菌斑的形成情况，例如：对人牙菌斑和唾液中淀粉酶和蔗糖酶的活性测定[2]、评定各类漱口水的作用效果、评估口腔卫生状况、药物等对菌斑中菌群的影响及菌斑中幽门螺杆菌的测定等。
这种提取技术简单、快速、易行，但易破坏菌斑的自然结构，而且不利于菌斑的动态观察，不能研究其演化发展过程。
1.2黏附体取样
在清洁处理后的牙面上放置内径2 mm的尼龙线圈，5 d后取下此装置，收集结构完整的牙菌斑，应用荧光素处理，再用荧光显微镜对其进行观察，镜下可见：由荧光素充满的空隙将密集的细菌群体分开，生物膜底层有许多不规则的、大小相近的圆形小凹，这是釉质表面的特征性结构。应用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）观察分析此方法获得的菌斑可发现：牙菌斑是成层样堆积的，细菌的聚集从釉质表面向上扩展形成蘑菇状，由液体充满的通道隔开，布满整个生物膜全层，通道在生物膜内类似一个初级循环系统，对维持细菌自身稳定有着重要的意义[3]。
此方法可以获取完整的自然菌斑，有利于保持牙菌斑的生物结构，并且能够灵活掌握实验时间，可以初步了解菌斑的形成过程和结构的动态演变。但其也存在一定的局限性，由于线圈细小，不易置入和取出，同时其在口腔中的稳定性较差。
1.3夹板取样
将直径为5 mm、厚度为1.5 mm的模拟釉质（羟磷灰石片）和玻璃芯片插入丙烯酸夹板中，固定于受试者口腔内，分别在1、2、3 d后取出平板，在平板表面即可获取自然生长的菌斑。可用此方法评估自然生长牙菌斑的生命力及形态，如探索牙菌斑生物膜中活菌和死菌空间分布[4]，研究牙齿修复材料对生物膜的影响[5]等。
1.4支架取样
利用人类未萌出的第三磨牙制成长2 mm、宽2 mm、厚1 mm的釉质薄片，将其放入超声池中清洁20 min后，用乙烯氧化物消毒，然后利用红色牙蜡将其固定于特制的丙烯酸支架上。制备2个双边下颌支架（横跨第一前磨牙到第一磨牙的颊侧面），每个支架上放置3个薄片。在插入支架前，去除受试者牙表面的可见菌斑并抛光牙表面。最后，将支架置入受试者口中，分别于4 h和8 h后取下观察[6]。此方法成功建立了体内菌斑生物膜的生长模型。由于本实验是应用未萌出的第三磨牙制取釉质磨片，与夹板取样中制作釉质磨片的材料相比更为优越，因为其采用的是无牙菌斑附着的天然釉质，更能反映出细菌在釉质上初步定植的情况。
继而又有研究者对这一方法进行了改进。研究者改造了口内的丙烯酸支架，在抛光直径为3 mm、厚度为2 mm的玻璃薄片后，将其用黏性蜡固定入支架的凹陷区域，随后将支架放入受试者口中48 h。要求受试者在实验过程，除了日常刷牙（仅用自来水）时可取下外，其他时间始终佩带实验装置进行日常饮食。最后，取下覆盖了菌斑的玻璃薄片，经荧光染色后在CLSM下观察。
改进后的方法与之前相比其优越性有以下2点：1）装置中特殊的凹陷设计可以使菌斑沿着舌或颊部自然生长，其受到口腔软组织剪切力的影响很小；2）装置中的玻璃薄片与牙面之间有大约2 mm的空隙，这样的特殊设计可以保证在取下和置换装置时不会干扰菌斑的重新生长[7]。此方法可应用于分析不同部位牙菌斑的生长情况，区分初始菌斑中链球菌和其他细菌[8]，分析牙菌斑生物膜中细菌的动态变化[9]等。
夹板与支架取样都避免不了需要设计支撑结构，这样不仅增加了实验的繁琐性与材料的耗费，而且夹板与支架的介入可能会破坏受试者原本的口腔微环境，降低了研究结果的可信度。
1.5可摘义齿取样
选择安装有局部可摘义齿的志愿者，在其基托的表面选择同一位置黏贴3片塑料片，分别戴用1、4、24 h后将塑料片完整取下，这样可获得完整的原位牙菌斑生物膜[10]。
这种方法不仅可以获得结构完整的牙菌斑生物膜，而且简便、稳定、重复性好，并且受试者几乎无不适感，是一种很好的获取原位、完整牙菌斑生物膜的方法。并且利用这一方法获得的原位牙菌斑生物膜，可用于研究膜内部的物质转运以及耐药性。
2体外提取技术
2.1细胞培养板
24个凹槽样的聚苯乙烯细胞培养板置于烧结的羟磷灰石盘上，用内氏放线菌、白假丝酵母菌、口腔链球菌、表兄链球菌、韦荣球菌、具核梭杆菌作为接种体，在其上培养菌斑生物膜。实验所用的羟磷灰石盘需要先在加工过的非刺激性唾液中镀一层薄膜包衣，再浸润于1.6 mL含有体积分数70%唾液和30%pH=7.2的胰蛋白胨发酵肉汤的底物中。取每种细菌等体积、等浓度的培养液，混合形成悬浊液（200μL），注入凹槽中，分别在培养16.5、20.5、24.5、40.5、44.5、48.5、64.5 h时，将生物膜连续3次置于2 mL消毒过的生理盐水中冲洗（室温条件下每次浸润1 min），最后用多聚甲醛固定。然后，将盘上的生物膜取下，在适宜的琼脂培养基上培养，以便观察研究。这种方法成功利用了杂交技术，在体外培养出含有多种细菌的混合菌斑，并利用革兰染色区分出不同的菌群[11]，主要应用于分析菌斑中特定菌群的特点及相互作用情况，还可用于研究化学物质等对含特定菌群菌斑的作用，如人粘蛋白7多肽对含有突变链球菌的菌斑生物膜的影响[12]，蔓越橘中的大分子物质对牙菌斑组成的影响[13]等。
2.2改良恒化器
研究者将分组的菌液接种于含2.5g·L-1600 mL猪胃黏蛋白的改良BM培养液的恒化器中，用氧化铝耐水砂纸磨去羟磷灰石圆片表面20μm，再经自来水冲洗以及高压灭菌后备用。羟磷灰石圆片由耐热塑料圈和不锈钢丝固定后置于液面下1~ 1.5 cm处，工作条件为：稀释率0.05·h-1，搅拌速度为50次·min-1，混合气体为80%氮气、10%氢气、10%二氧化碳，37℃，pH值为7.0±0.1[14]。
由于口腔环境不易控制，菌斑异质多变，生态环境复杂，使体内研究存在许多困难，这种方法中应用的改良恒化器能模拟口腔各项参数，可方便地固定、移动和复位几十片羟磷灰石，并可长时间连续培养及维持细菌生长的对数期，同时可控制接种细菌的种类、数量和次序[15]。因此，可利用改良恒化器研究菌斑生物膜及悬浮液的结构组成、细菌代谢和相互关系，检测抗菌药物的作用效果[16]等。
2.3恒定深度薄膜发酵槽
恒定深度薄膜发酵槽（constant-depth film fermenter，CDFF）可以产生稳定状态的口腔生物膜，这种生物膜比在恒化器系统中产生的生物膜更具有代表性，其控制条件更接近口腔真实微环境。CDFF的基本装置是一个带有凹陷腔洞的转盘，可将羟磷灰石放入腔洞中，多余的生物膜和液体基质可被装置中的刀片除去，从而使生物膜保持在一定深度中。研究者将支持生物膜的羟磷灰石盘置于深200μm的腔洞之中，培养物通过0.2μm的过滤器与大气相通，从而成功获取实验所需的菌斑生物膜[17]。此方法还被应用于研究与疾病相关的微生物菌群模型的改变[18]，不同营养条件下牙菌斑结构的变化[19]，牙菌斑光学治疗中潜在的光敏材料[20]，抗生素对菌斑的影响及抗菌谱[21]等。
3结束语
牙菌斑口内提取技术有利于观察菌斑的自然形态，研究其内部的多种细菌组成及相互作用关系，但是受多种客观因素的影响，实验条件多变，不易控制，同时取出后的菌斑不易长时间暴露于体外环境，以免干扰其自然形态，于是不利于长期的动态观察与研究。除此，一些药物及不良刺激的研究会对人体造成一定伤害。体外培养方法成功克服了这些弊端，使得以往在口腔内无法进行的实验可以进行，实验者可以灵活模拟各种所需的实验条件，最大程度的减少客观因素的干扰，如个体口腔卫生、食物、疾病等，从而保证菌斑在恒定的条件中生长。此外，还可以选择性的培养菌斑中的微生物。但是，由于口腔环境是复杂多变的，人为控制的体外提取技术不能真实再现口腔环境，除此，牙菌斑内有细菌种类约200~400种，仅有1%~10%是可培养的，仅几种细菌的组合是无论如何也代表不了这样一个微生态牙菌斑环境的[1]。所以，体外提取技术培养的菌斑与自然菌斑存在着差异，其实验价值也存在一定的局限性。
随着实验技术的不断提高，菌斑提取技术可尝试将口内提取与口外培养合理结合，保证菌斑自然形态的同时，在模拟体内的体外培养环境中动态观察菌斑生物学特征，进行定性及定量研究分析。口腔自然牙菌斑的获取还可以与临床治疗方法相结合，如正畸治疗中使用的托槽、分牙环、矫治器上均可以用来培养菌斑，而且这样获取的菌斑与口腔内自然形成的菌斑非常类似，受客观因素的影响很小。除此之外，菌斑还可以形成于口腔修复医学中所使用的烤瓷牙冠的表面，从而获取不同牙面的自然菌斑，扩展自然菌斑的研究方向。
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