摘要植株在逆境下经常会遭受氧化胁迫，为了探讨叶绿体抗坏血酸过氧化物酶（tAPX）与其抗氧化性的关系，从番茄叶片中分离得到类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因（StAPX），利用农杆菌介导的叶盘法并转入烟草中。以野生型（WT），转正义StAPX烟草株系T3-3和T3-6为试材，测定了百草枯（MV）诱导的氧化胁迫条件下APX酶活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢（H2O2）含量、超氧阴离子（O2-）含量、种子发芽率及种苗的生长量变化等。结果表明，氧化胁迫下转基因烟草的种子发芽率、种苗的生长量、抗氧化酶活性和清除活性氧的能力都显著高于野生型。这些结果表明，StAPX的过量表达有助于提高烟草的发芽率及种苗的抗氧化能力。
关键词MV氧化胁迫；叶绿体类囊体膜APX基因；转基因烟草；抗氧化性
中图分类号S572；Q945.78文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0013-03
PerformanceofTobaccoPlantsOverexpressingStAPXunderMethylviologen-mediatedOxidativeStress
SUN Wei-hongMO Ming-huiSUN Lan-lanLIANG Long-quanZHOU YueWU Juan
（College of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013）
AbstractPlants often suffer oxidative stress under adverse growth conditions.In order to investigate the relationship between chloroplast ascorbate peroxidase（tAPX） and the tolerance to oxidative stress，WT，sense-transgenic lines T3-3 and T3-6 of tobacco were used to measure activities of APX and superoxide dismutase（SOD），the content of hydrogen peroxide（H2O2） and super-oxide anion radical（O2-），germination rate of seeds，and capacity of plant growth under oxidative stress. Activities of APX，the capability for scavenging H2O2，seed germination and growth capacity of the transgenic tobacco plants were distinctly higher than those of WT after MV treatment. Overexpression of StAPX in tobacco improved germination rate of seeds and seedling growth capacity under methylviologen-mediated oxidative stress.
Key wordsmethylviologen-mediated oxidant stress；StAPX；transgenic tobacco plant；resistance to oxidant stress
逆境胁迫是目前农业生产面临的严峻问题之一，导致作物产量和品质降低。需氧气生物细胞在其代谢过程中总会产生一些活性氧（ROS）物质，非生物胁迫均可以导致ROS，如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子自由基（O2-）、单线态氧、羟基自由基等[1]的大量产生。若未及时清除， ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤，进而导致细胞及组织死亡。植物为了清除过多的ROS，其本身会逐步地产生包括抗氧化酶类如过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD），还有一些小分子物质等[2]，作为相应的保护机制。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一，环境胁迫下叶绿体内产生的ROS的快速清除有助于保护光合机构，维持植物光合功能。植物的ROS物质中最主要的一种就是H2O2，清除H2O2的关键酶之一是叶绿体中的APX[3]。因此，研究APX基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。研究发现，过量表达叶绿体APX能够提高植物的耐逆性[4]。定位在叶绿体的APX 包括基质APX（sAPX）和类囊体膜APX（tAPX）。Murgia等[5]的研究结果表明超量表达拟南芥tAPX基因能增加由百草枯引起的氧逆境抗性。笔者将叶绿体类囊体膜APX基因（StAPX）从番茄叶片克隆出来，利用农杆菌介导的叶盘法转入烟草，并对该基因的抗氧化功能进行了分析，结果表明转StAPX基因烟草种苗提高了百草枯（MV）诱导的氧化抗性。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为烟草（Nicotiana tabacum L.）（NC89），选取转基因烟草T3代（T3-3和T3-6）及野生型（WT）植株生长至4周。
1.2试验设计
试验共设3个处理，分别为：MV（百草枯）的浓度为50 μmoL/L（A）、100 μmoL/L（B），以清水作为对照（CK）。
1.3试验实施
烟草种子用不同浓度MV浸泡处理后，进行表面消毒，摆放于MS培养基中。种子浸种催芽生根后种植在江苏大学温室内，温度为（25± 5）℃，光照强度100~800 μmoL/（m?2 ·s），相对湿度75%± 5%。用不同浓度MV喷施处理24 h，取叶片，液氮冷冻，保存于-80 ℃备用。
1.4测定内容与方法
1.4.1种子发芽率测定。种子在0、50、100 μmoL/L MV中浸泡12 h后经表面灭菌种在30 mL MS培养基中，每个培养皿中大约30粒种子。25 ℃光照培养箱中（光16 h，暗8 h）放置，15 d后测定发芽率。每处理至少3次重复。
1.4.2抗氧化酶活性测定。取烟草各株系处理和对照叶片20 g，参照Robinson等[6]的方法提取叶绿体。tAPX酶活性测定参照Amako等[7]的方法进行。叶绿体SOD酶活性测定参照Giannopolitis等[8]的方法进行，于560 nm条件下测定吸光值。以上测定每处理重复3次，结果以平均值±标准误差表示。
1.4.3活性氧含量测定。H2O2含量的测定参照Ferguson等[9]的方法进行，丙酮抽提，提取液在钛盐（TiCl4）与浓HCl的混合物和浓氨水反应，将所生成的过氧化物离心沉淀。沉淀溶于1 mmoL/L H2SO4中，于415 nm下测定吸光值。O2-含量测定参照王爱国等[10]的方法进行，于530 nm下测定吸光值。以上测定每处理重复3次，结果以平均值±标准误差表示。
1.4.4叶绿素含量测定。参照Hemavathi 等[11]方法测定叶片的叶绿素含量。将处理后的叶圆片转移至10 mL离心管中，加入2 mL 80%丙酮于暗处放置，进行充分提取，3 500 g离心5 min，取上清分别测定663、646 nm吸光值。同时于MV处理后检测烟草叶片的氧化损伤情况，以相对百分值来表示叶片可见损伤情况。
1.4.5植株生长量测定。对2周大小的烟草植株进行氧化胁迫处理：每2 d用含有0、50、100 μmoL/L MV的100 mL营养液浇灌，连续处理2周，每处理至少重复3次。处理完毕后收获根和茎杆，立即测定鲜重，于70 ℃烘箱烘干48 h后测定干重。结果以平均值±标准误差表示。
2结果与分析
2.1发芽率
在无胁迫条件下转基因和野生型烟草种子发芽率均为95%左右，而在MV胁迫条件下，转基因和野生型烟草种子发芽率均有所下降，但转基因种子发芽率明显高于野生型，具体发芽情况见表1。结果表明，在逆境胁迫条件下，转StAPX基因烟草种子具有一定的抗氧化能力，过量表达StAPX基因提高了烟草种子发芽率。
2.2抗氧化酶活性和清除活性氧能力
试验结果表明，过量表达StAPX基因提高了抗氧化酶活性和清除活性氧能力。在正常生长条件下，转基因植株tAPX酶活性几乎是野生型的2倍。100 μmoL/L MV胁迫处理24 h时，T3-3、T3-6和WT的tAPX酶活性分别为各CK的1.92、2.02、1.12倍（图1）。说明氧化胁迫下转基因植株H2O2清除tAPX酶活性显著高于野生型植株。100 μmoL/L MV氧化胁迫24 h时，T3-3、T3-6和WT的SOD酶活性分别为各CK的1.17、1.22、0.75倍（图2）。与CK相比，氧化胁迫导致转基因和野生型植株叶片中的ROS含量明显增加。100 μmoL/L MV胁迫处理24 h时，T3-3、T3-6和WT的H2O2含量分别为各CK的1.51、1.43、2.59倍（图3）；T3-3、T3-6和WT的O2-含量分别为各CK的1.72、1.67、2.28倍（图4）。
2.3叶绿素降解速度
MV处理24 h后，所有叶片表现出不同程度的失绿，100 μmoL/L MV胁迫处理后部分叶片呈现局部枯死斑，尤其是野生型植株叶片可见伤害度更严重（叶片可见伤害度以相对值表示）。转正义基因植株叶片失绿程度较轻，与之相对应的是其维持有较高的叶绿素含量（图5、图6）。说明过量表达StAPX基因降低了叶绿素的降解速度。
2.4植株生长量
转基因烟草和野生型植株用不同浓度MV处理2周后，其生长情况比对照有所下降，野生型植株的总体生长受抑制情况更明显，且随着MV含量的增加，植株受抑制情况随之增加。试验表明，MV处理降低了植株的鲜重和干重，且野生型植株的根长、鲜重、干重等生长情况明显低于转基因植株（表2）。说明过量表达StAPX基因提高了植株生长量。
3结论与讨论
H2O2是一种对植物具有毒害作用的活性氧，它是叶绿体中某些酶学反应和光合电子传递的天然产物。据报道，H2O2及其所产生的羟基自由基会破坏叶绿体和其他细胞组分，而MV诱导的氧化胁迫的靶基因，即叶绿体APX[12]可以保护其免受破坏。植物的抗逆能力在一定程度上可以通过其种子在萌发阶段的耐逆状况来反映，研究表明，种子细胞膜的结构和功能会被逆境胁迫所破坏，使其活力降低，导致代谢紊乱，乃至失去萌发能力[13]。本试验MV氧化胁迫降低了种子发芽率。使用MV浸泡种子造成ROS等自由基的大量积累，启动了膜脂过氧化或膜蛋白过氧化作用，造成膜脂或膜蛋白损伤，从而破坏膜结构，使质膜的透性增加，影响种子发芽率。而此时转基因种子膜结构破坏较轻，且其tAPX酶活性可能在种子萌发起就能够开始表达，清除ROS的能力会提高，从而提高了氧化胁迫下烟草种子的发芽率。
普遍观点认为，逆境引起的损伤是膜脂过氧化水平增高和保护酶系统活性下降的结果。MV 被认为是一种高效的电子受体，能够传递分子氧而形成O2-和H2O2[14]。本试验中MV处理造成了植物体内ROS的积累，同时启动植物抗氧化防御体系，增强膜保护酶tAPX和SOD活性，加强细胞内H2O2和O2-的清除能力，从而一定程度上抑制ROS的积累。烟草体内O2-和H2O2水平随着胁迫时间的持续延长而持续增加，抑制了tAPX和SOD酶活性，降低了植物清除ROS的能力。在氧化胁迫过程中，tAPX活性几乎与叶绿体H2O2含量呈负相关，而SOD活性几乎与O2-含量呈负相关（图1）。以上结果表明当植物受到逆境胁迫后，tAPX基因能迅速表达，最大限度地抵抗逆境伤害。当植物对逆境适应之后或膜结构遭受严重逆境损伤，该酶表达量即开始下降。但转正义基因株系叶绿体中APX酶活性总比野生型相对高，能够降低H2O2的积累，从而减轻活性氧对植物的伤害。
活性氧代谢涉及光抑制及其防御机理，同时活性氧可直接破坏叶绿素分子，对光合作用造成非气孔限制。本试验证明在氧化胁迫下植株叶片叶绿素含量与坏死程度呈负相关，而转正义基因植株叶片具有较高的叶绿素含量。结果表明，过量表达StAPX基因的烟草植株能快速地清除活性氧，降低氧化损伤，具有一定光合器官保护能力。
生长量是植物对逆境胁迫的综合反应。烟草光合速率在MV氧化胁迫下降低，MV胁迫下烟草的生长量与对照相比呈下降趋势。随着MV浓度的增高，植物体产生的活性氧等有毒物质积累，植物为清除过多的ROS需要提高抗氧化酶活性，维持较高的光合能力，以降低氧化损伤。本试验中氧化胁迫条件下野生型烟草幼苗生长受到显著抑制，而转StAPX烟草的鲜重、干重都高于野生型，表明了过量表达该基因的抗氧化能力增强。这也正类似于Yabuta等[15]报道的转反义烟草tAPX基因的烟草植株生长受抑的结果。研究结果证明，在烟草中过量表达StAPX基因能够有效清除ROS，从而提高了MV诱导的氧化胁迫抗性，提高了种子发芽率和种苗生长量。
4参考文献
[1] ASADA K.The water-water cycle in chloroplasts：scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1999（50）：601-639.
[2] NOCTOR G，Foyer GH. Ascorbate and glutathion：keeping active oxygen under control[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1998（49）：249-279.
[3] ASADA K.Ascorbate peroxidase- a hydrogen peroxide-scavenging enzy-me in plants[J].Physiol Plant，1992（85）：235-241.
[4] BADAWI G H，KAWANO N，YAMAUCHI Y，et al.Overexpression of ascorbate peroxidase in tobacco chloroplasts enhances the tolerance to salt stress and water deficit[J].Physiol Plant，2004（121）：231-238.
[5] MURGIA L，TARANTINO D，VNANINI C，et al.Arabidopsis thaliana plants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show increased resistance to paraquat-induced photooxidative stress and to nitric oxide-induced cell death[J].Plant J，2004（38）：940-953.
[6] ROBINSON S P，DOWNTON W J，MILLHOUSE J A.Photosynthesis and ion content of leaves and chloroplasts of salt stressed spinach[J].Plant Physiol，1983（73）：238-242.
[7] AMAKO K，CHEN G X，ASADA K.Separate assays specific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidasein plants[J].Plant Cell Physiol，1994（35）：497-504.
[8] GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases.I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol，1977（59）：309-314.
[9] FERGUSON I B，WATKINS C B，HARMAN J E.Inhibition by calcium of senescence of detached cucumber cotyledons[J].Plant Physiol，1983（71）：182-186.
[10] 王爱国，罗广华.植物的超氧物自由基与羟胺反应的定量关系[J].植
（下转第18页）
（上接第15页）
物生理学通讯，1990（6）：55-57.
[11] HEMAVATHI，UPADHYAYA C P，AKULA N，et al.Enhanced ascor-bicacid accumulation in transgenic potato confers tolerance to various abiotic stresses[J].Biotechnol Lett，2009（32）：321-330.
[12] MANO J，OHNO C，DOMAE Y，et al.Chloroplastic ascorbate peroxidase is the primary target of methylviologen-induced photooxidative stress in spinach leaves：its relevance to monodehydroascorbate radical detected with in vivo ESR[J].Biochim Biophy Acta，2001，1504（2-3）：275-287.
[13] 贺军民，佘小平，张键.番茄种子吸湿—回干处理对盐胁迫伤害的缓解效应[J].园艺学报，2000（27）：123-126.
[14] CORNIC G，BUKHOV N G，WIESE C，et al.Flexible coupling between light-dependent electron and vectorial proton transport in illuminated leaves of C3 plants.Role of photosystem I-dependent proton pumping[J]. Planta，2000，210（3）：468-477.
[15] YABUTA Y，MOTOKI T，YOSHIMURA K，et al.Thylakoid membrane-bound peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress[J].Plant J，2002（32）：915-925.
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