[摘要] 目的 探讨斑贞1号、川芎嗪（TMP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）联合逆转人胃癌细胞系SGC-7901/ADR与LRP表达的相关性。 方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）比较人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞在单纯5-FU和5-FU联合斑贞1号及TMP处理组肺耐药蛋白（LRP）mRNA的表达情况。 结果 5-FU组与阴性对照组比较，LRP mRNA表达差异无统计学意义（P > 0.05）；而5-FU联合斑贞1号及TMP处理组LRP mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 斑贞1号、TMP和5-FU联合逆转SGC-7901/ADR细胞耐药性可能与LRP基因相关，为当前胃癌的治疗提供了新的理论依据。
[关键词] 胃癌；斑贞1号；川芎嗪；5-氟尿嘧啶；多药耐药；LRP基因
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）04（a）-0029-02
Effect of Banzhen 1, Tetra methylpyrazine and 5 Fluorouracil on lung resistance protein of human gastric cancer cells gene expression
XUE Ximei1FU Guizhen2ZHANG Aimin3
1.Center of 18 Friendship Community, Baogang Hospital of Inner Mongolia, Inner Monggol Autonomous Region, Baotou014030, China; 2.Huade County Hospital of Wulanchabu City, Inner Monggol Autonomous Region, Huade013350, China; 3.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology, Inner Monggol Autonomous Region, Baotou014010, China
[Abstracts] Objective To explore of the correlativity between Banzhen 1, Tetra methylpyrazine (TMP) and 5 Fluorouracil (5-Fu) reversing human gastric cancer cell line SGC-7901/ADR with lung resistance protein (LRP) expressions. Methods Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used for comparison of LRP mRNA expression for cell line SGC-7901/ADR in group of 5-FU, 5-FU combined with Banzhen 1 and Tetramethylpyrazine (TMP). Results The expression of LRP mRNA between the 5-FU group and the control group, there was no significant difference (P > 0.05), while 5-FU and Banzhen 1 group and Tetra methylpyrazine (TMP) group was decreased significantly with significant difference (P < 0.05). Conclusion It is possible correlated to LRP for Banzhen 1, TMP and 5-FU reversed multidrug resistance in human gastric cancer cells, which may supply a new theoretical basis for the clinical effective treatment of gastric carcinoma.
[Key words] Stomach cancer; Banzhen 1; TMP; 5-FU; Multidrug resistance; LRP genes
化疗是治疗胃癌的有效手段之一，但胃癌多药耐药性（MDR）是导致化疗失败的主要原因。近几年发现肺耐药相关蛋白（lung resistance-related protein，LRP）在胃癌多药耐药性方面起着重要作用，本课题先前已证实斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。因此笔者在此实验的基础上，通过检测不同药物组LRP mRNA的表达量从分子生物的角的进一步探讨斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞系
耐阿霉素人胃癌细胞株SGC-7901/ADR细胞，西安西京医院消化研究所提供。
1.2 药物、试剂及主要仪器
斑贞1号由斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸按一定比例组成由内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院制备，每1 mL含原生药0.2 g，4℃保存。
TMP（浙江新华制药有限公司），5-FU（南通精华制药有限公司产品），RPMI1640（美国GIBCO公司产品），新生小牛血清（赛默飞世尔生物化学制造），二甲基亚砜（DMSO）及胰蛋白酶（美国Sigma公司产品），RT-PCR试剂盒及Trizol（TakaRa公司），引物（上海生工生物工程有限公司），PCR扩增仪（美国AB公司产品），电泳仪（DF-D，北京），紫外分光度计（SFZ0806011349，上海）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞处理 取SGC-7901/ADR细胞（在接种两周前培养于不含ADM的培养液中）对数生长期，以5×104 mL每孔2 mL，接种于6孔板上，然后培养24 h，实验孔分别标记为对照组、5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号+5-FU组、斑贞1号+5-FU+TMP组。每孔分别加入等量的新的培养液、5-FU稀释液、斑贞1号稀释液、5-FU+斑贞1号、5-FU+TMP+斑贞1号（各组药物浓度根据MTT试验结果，选取各自的IC50值）。然后继续培养48 h，用PBS缓冲液冲洗一次，准备提取总mRNA。
1.3.2 RT-PCR检测 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，以mRNA为模板经逆转录合成cDNA，引物LRP基因序列的正义列5ˊ-CATCATTCGCACTGCTGTCT-3ˊ，反义列引物为5ˊ-TTTCTCGGCTTCTGACTGGT-3ˊ，β-actin的正义列为5ˊ-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3ˊ，反义列为5ˊ-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3ˊ，先逆转录出cDNA，每个样品反应体系25 μL，即dNTP Mixture 2 μL，Takara Taq 1 μL，ddH2O 13.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，各样品cDNA 5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，灭菌蒸馏水13.5 μL。预变性94℃ 2 min→变性94℃ 30 s→退火58℃ 30 s→延伸72℃ 1 min，共30个循环，最后延伸72℃ 10 min。扩增结束后，取样品10 μL，2％琼脂糖，100 V恒压电泳60 min。紫外反射透射分析仪采集电泳图像，凝胶图象分析系统扫描得到各电泳带平均吸光度值。
1.4 统计学方法
应用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SGC7901/ADR细胞经不同药物处理后LRP mRNA的表达
5-FU组LRP mRNA表达量为（1.44±0.25）%，对照组为（1.49±0.27）%，两者比较差异无统计学意义（P = 0.66 > 0.05）。其他药物组与对照组及组间比较差异均有统计学意义（均P ＜ 0.05），其中斑贞1号+FU+TMP组表达量最少。见表1。
表1SGC7901/ADR细胞肺耐药蛋白（LRP）mRNA在不同药物组表达（x±s）
注：与对照组比较，*P ＜ 0.05；与5-FU组比较，△P ＜ 0.05；与斑贞1号组比较，#P ＜ 0.05；与斑贞1号+5-FU组比较，@P ＜ 0.05
2.2 细胞经不同药物处理后LRP mRNA的表达
所有RT-PCR扩增产物均产生β-actin基因扩增带，证实逆转录所得cDNA的完整性和PCR反应是成功的。LRP和β-actin的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于257bp和548bp，与预期长度吻合，说明均为特异性扩增片段。见图1。
3 讨论
在我国胃癌发病率及死亡率居恶性肿瘤第二[2]，化疗是综合治疗胃癌的重要方法之一，但肿瘤的MDR是导致化疗失败的主要原因之一[3]。本课题组先前已证实人胃癌细胞系SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性，相对耐药性为97.49[4]。LRP是近年来被发现的重要耐药基因，定位于16号染色体，是一种分子量为110 kD的非糖蛋白，且细胞器与穹窿体同源。Yu等[5]报道在胃肠道肿瘤中，LRP的阳性表达率明显高于正常胃肠道组织，提示LRP在胃癌的原发性耐药中发挥重要作用。目前认为LRP参与肿瘤细胞MDR机制：①使以胞核为靶点的药物不能通过核孔进入胞核，即使进入胞核内药物也可以被泵出核外；②使胞浆中药物进入囊泡，并通过吞噬作用排出细胞外，故认为LRP介导以DNA为靶点的药物的耐药性[6]。本文显示，5-FU组LRP mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义（P = 0.66＞0.05），说明LRP参与耐药细胞对5-FU的耐药性。
斑贞1号合剂主药为斑蝥和露蜂房，辅佐药为女贞子和山茱萸，其各成分用量（60 kg）是成人的临床用量。斑蝥素能抑制肿瘤细胞核酸合成，具有解毒杀瘤作用，而且无骨髓抑制作用。女贞子具有扶正祛邪，对染色体损伤和突变效应具保护作用，且能增强机体免疫力，TMP是一种中药钙离子通道阻滞剂，可通过多种途径对肿瘤起到治疗和逆转多药耐药作用。本课题组先前已证实300 mg/LTMP能显著增加SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性[7]；斑贞1号、TMP联合5-FU对SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。本文显示，斑贞1号+5-FU+TMP LRP mRNA表达量明显低于其他用药组，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明三种药联合可显著抑制耐药细胞LRP mRNA的高表达，克服了由LRP基因介导的多药耐药性，增强了治疗效果。
[参考文献]
[1] 侯培珍，张娟，赵永峰.中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J].第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.
[2] Yang L. Incidence and mortality of gastric cancer in China [J]. World J Gastroenterol，2006，12：17-20.
[3] 布立民，韩英.逆转胃肠道肿瘤多药耐药的研究进展[J].实用癌症杂志，2002，18（1）：105-107.
[4] 郝旺胜，侯先文，侯培珍.斑贞1号联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的细胞毒作用[J].临床荟萃，2008，23（24）：1762-1764.
[5] Yu DQ，Yi YF. Expression and significance of MRP，GST-pi，Topo IIalpha，and LRP in gastric carcinoma [J]. Ai Zheng，2003，22：496-499.
[6] 王俊普，李景和，王宽松．胃癌耐药机制研究进展[J].世界华人消化杂志，2009，17（16）：2692-2699．
[7] 杨叶，侯培珍，张娟.川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的杀伤作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.
（收稿日期：2011-12-15 本文编辑：卫 轲）
