摘 要 以橡胶树转基因材料为研究对象，首次基于载体左右边界序列设计的特异引物进行载体骨架序列的初步PCR检测，结果表明，15个转基因阳性株系中有5个和2个株系分别含有左侧和右侧的边界序列，占33.3%和13.3%，结合这些株系PCR产物的序列分析结果进一步证实除T-DNA区以外的载体骨架序列确实整合到这些株系的植物基因组中。同时对载体骨架序列存在的弊端及可能的解决途径做了相应的分析。
关键词 橡胶树；转基因；载体骨架序列；PCR
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
传统观点普遍认为在遗传转化过程中，T-DNA边界之外的载体序列或载体骨架序列（vector backbone sequences）不可能转移至宿主植物细胞中[1]，然而，针对多种物种的转基因整合模式的研究结果表明，T-DNA区域以外的载体骨架序列经常插入到植物基因组中[2-8]。不过有关骨架序列的整合机制还有待于深入的研究。
研究结果表明，载体骨架序列整合进植物染色体中可能会产生重组热点或导致异常重组，进而影响目标基因的表达[9]，转基因后代中也易发生目标位点的丢失与表达沉默等[10-11]。在转基因植物批准商业化过程中，决策部门要求提供插入到植物染色体上DNA的全部序列信息，且不能含有载体骨架序列[6]；而且非目的基因外源DNA片段的存在是否造成生物安全性尚无定论，这些都给转基因过程中载体骨架序列的存在产生了负面影响，也成为了目前植物基因工程研究的热点之一。
橡胶树转基因起步相对较晚，目前大多数的研究主要集中在遗传转化过程的优化、目的基因的整合及表达情况等方面，对于载体骨架序列的发现及其整合现象还未见相关的研究报道。
本研究在对橡胶树转基因植株进行阳性鉴定的同时，首次根据载体左右边界序列设计特异引物对载体骨架序列进行了初步的PCR分析，结果表明在遗传转化过程中，载体骨架序列确实随着T-DNA区一同转移至橡胶树基因组中，这也是目前在橡胶树遗传转化研究中首次报道。由于载体骨架序列的存在可能会影响基因的表达及在批准商业化时不能存在载体骨架序列，因此，有必要对转基因植物的载体骨架序列进行研究。笔者对橡胶树转基因植株中的载体骨架序列进行初步的分析，并对其消除的意义及解决措施做了相应的讨论，以期在后续的实验过程中采取措施加以剔除，达到仅保留目标基因片段与植物染色体融合，最终降低后续的相关风险。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用的实验材料为本课题组于2007～2009年以橡胶树（Hevea brasiliensis）花药愈伤组织为外植体，通过农杆菌介导的遗传转化方法获得的转基因植株稳定期叶片。26个转基因株系于2011年11月定植于中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃，每个株系定植3株，共成活59株；同时以未转化花药胚为初生胚通过次生体胚发生增殖后再生的3株组培苗作为对照株系，总计62株。所有材料均经过载体上的抗生素特异引物检测以及GUS染色分析的方法确定其是否为阳性单株，共检测出15个转基因阳性株系（37份植株），具体检测结果见文献报道[12]。Tj200863、TP0828、T2009519、Tj2008171、T2009626和T2009401六个株系经southern检验确定目的基因已整合进基因组中（结果未发表），这62株均作为载体骨架序列的分析材料。
PCR反应所需要的Taq酶购于Fermentas公司，100 bp DNA Ladder购于北京全式金生物技术有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit购于OMEGA公司，pMDR-19T vector（TaKaRa）购于大连宝生物公司。
1.2 方法
1.2.1 DNA制备 叶片（稳定期）基因组DNA的制备方法参照文献报道的方法[12]。（1）取两个离心管盖大小的叶片直接置于研钵中，加入65 ℃预热的600 μL裂解液，研磨至匀浆状，转移匀浆至2.0 mL的离心管内；（2）加入等体积的24 ∶ 1（氯仿 ∶ 异戊醇）进行抽提，无需先用25 ∶ 24 ∶ 1（酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇）抽提；（3）加入100 μL的ddH2O和1 μL的RNaseA（10 mg/mL），37 ℃温浴至DNA完全溶解，不需要进行纯化处理，直接置于-20 ℃备用。DNA的提取质量采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 PCR分子检测 根据表达载体左右边界（LB和RB）附近区间的序列采用Primer5设计PCR扩增引物（表1），其中1条引物设定在T-DNA边界区附近（LB引物设计在T-DNA区内，RB引物设计在距离T-DNA边界区25 bp处），另外1条引物锚定在载体骨架区（图1）。对于所用的PCR分子检测引物优先在空白对照、阴性对照以及阳性对照中进行扩增，选择在空白对照和阴性对照中无扩增产物，仅在阳性对照中能扩增出预期大小的片段的引物进行转基因植株的检测。载体骨架序列左右边界检测的引物分别命名为TL-L/R和TR-L/R，TL-L/R和TR-L/R扩增的片段大小分别为872 bp和525 bp。引物序列由华大基因合成。
PCR总反应体系为15 μL，组成为10×Taq Buffer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 1.2 μL；10 mmol/L dNTPs 0.3 μL；5 U/μL Taq酶0.15 μL；10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，上述DNA溶液2 μL，灭菌水补足至15 μL。PCR反应参数为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，引物TL-L/R 67 ℃复性40 s（引物TR-L/R 66 ℃复性40 s），引物TL-L/R 72 ℃延伸1 min（引物TR-L/R 72 ℃延伸40 s），35个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR检测时，分别以水做空白对照，未经遗传转化的橡胶树叶片基因组DNA为阴性对照，含有目的基因的表达载体质粒为阳性对照。
1.2.3 PCR产物的回收 TL-L/R和TR-L/R两对引物扩增出转基因单株的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，选择转基因株系中的一个单株扩增的目标条带进行挖胶，用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（OMEGA）对目的产物回收，并将回收产物取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 PCR产物的克隆与序列分析 将PCR产物回收纯化后与pMDR-19T vector（TaKaRa）连接，方法参照载体试剂盒说明书。转化大肠杆菌DH5α，鉴定并挑选至少两个阳性克隆送至华大基因测序，其中TL-L/R鉴定的转基因植株进行双向测序，而TR-L/R鉴定的转基因植株进行单向测序即可。测序获得的序列采用LASERGENE 6.0中的Seqman软件去除载体序列后进行片段拼接。利用MUSCLE 软件（http：//.cn/qkpdf/rdxb/rdxb201402/rdxb20140213-1.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文
参考文献
[1] Zambryski P C. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant MOI Biol， 1992， 43： 465-490.
[2] Martineau B， Voelker T A， Sanders R A. On defining T-DNA[J]. The Plant Cell， 1994， 6（8）： 1 032-1 033.
[3] van der Graaff E， den Dulk-Ras A， Hooykaas P J J. Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants[J]. Plant Mol Biol， 1996， 31： 677-681.
[4] Kononov M E， Bassuner B， Gelvin S B. Integration of T-DNA binary vector‘backbone’ sequences into the tobacco genome： evidence for multiple complex patterns of integration[J]. The Plant Journal， 1997， 11（5）： 945-957.
[5] Wenck A， Czakó M， Kanevski I， et al. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the whole binary vector during Agrobacterium-mediated transformation[J]. Plant molecular biology， 1997， 34（6）： 913-922.
[6] De Buck S， Wilde C D， Montagu M V， et al. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation[J]. Molecular Breeding， 2000， 6： 459-468.
[7] Abdal-Aziz S A， Pliego-Alfaro F， Quesada M A， et al. Evidence of frequent integration of non-T-DNA vector backbone sequences in transgenic strawberry plant[J]. Journal of bioscience and bioengineering， 2006， 101（6）： 508-510.
[8] 马小波， 王芙蓉， 张传云， 等. 多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定[J]. 棉花学报， 2008， 20（1）： 9-13.
[9] Iglesias V A， Moscone E A， Papp I， et al. Molecular and cytogenetic analyses of stably and unstably expressed transgene loci in tobacco[J]. Plant Cell， 1997， 9： 1 251-1 264.
[10] Stoger E， Williams S， Keen D， et al. Molecular characteristics of transgenic wheat and the effect on transgene expression[J]. Transgenic Res， 1998， 7： 463-471.
[11] 王利华， 苏 乔， 包永明. 转基因植物中载体骨架序列的安全性隐患及解决方案[J]. 中国生物工程杂志， 2004， 24（5）： 38-42.
[12] 李 季， 黄天带， 蔡海滨， 等. 橡胶树转基因植株遗传稳定性分析[J]. 热带作物学报， 2013， （4）： 591-595.
[13] Edgar R C. MUSCLE： multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Res， 2004， 32： 1 792-1 797.
[14] De Greve H， Nguyen V K， Deboeck F， et al. T-DNA tagging of the translation initiation factor eIF-4Al of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Sci， 2001， 161（4）： 685-693.
[15] Zhu Q H， Ramm K， Eamens A L， et al. Transgene structures suggest that multiple mecha-nisms are involved in T-DNA integration in plants[J]. Plant Sci， 2006， 171（3）： 308-322.
[16] Shou H， Frame B R， Whitham S A， et al. Assessment of transgenic maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated transformation[J]. Mol Breed， 2004， 13（2）： 201-208.
[17] Wolters Am-A， Trindade L M， Jacobsen E， et al. Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres as a tool to analyse complex T-DNA loci in potato[J]. Plant J， 1998， 13： 837-847.
[18] Cluster P D， O"Dell M， Metzlaff M， et al. Details of T-DNA structural organization from a transgenic Petunia population exhibiting co-suppression[J]. Plant Mol Biol， 1996， 32： 1 197-1 203.
[19] Kuraya Y， Ohta S， Fukuda M， et al. Suppression of transfer of non-T-DNA ‘vector backbone’ sequences by multiple left border repeats in vectors for transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular Breeding， 2004， 14： 309-320.
[20] 成善汉， 谢从华， 柳 俊， 等. 马铃薯转基因株系载体骨架的整合分析[J]. 海南大学学报（自然科学版）， 2006， 24（3）： 305-308.
[21] Sallaud C， Meynard D， van Boxtel J， et al. Highly efficient production and characterization of T-DNA plants for rice （Oryza sativa L.）functional genomics[J]. Theor Appl Genet， 2003， 106： 1 396-1 408.
[22] van Haaren M J J， Pronk J T， Schilperoort R A， et al. Functional analysis of the Agrobacterium tumefaciens octopine Ti-plasmid left and right T-region border fragments[J]. Plant Mol Biol， 1987， 8： 95-104.
[23] Xiang C B， Han P， Lutziger， et al. A mini binary vector series for plant transformation[J]. Plant Molecular Biology， 1999， 40（4）： 711-717.
[24] Hanson B， Engler D， Moy Y， et al. A simple method to eich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences[J]. The Plant Journal， 1999， 19（6）： 727-734.
[25] 董志峰， 马荣才， 彭于发， 等. 转基因植物中外源非目的基因片段的生物安全研究进展[J]. 植物学报， 2001， 43（7）： 661-672.
[26] 马小波. 农杆菌介导获得的转基因棉花基因组中外源基因结构与整合方式[M]. 济南： 山东师范大学图书馆， 2007.
