对照组的2.78、1.93倍，12号菌液的D600 nm分别是对照组的3.66、4.66倍，因此，2株固氮菌能有效耐受一定浓度的对羟基苯甲酸。生理生化分析结果显示，2株菌均具备水解淀粉、分解丙酮酸和产生吲哚的能力。16S rRNA测序及遗传进化分析结果显示，7号菌、12号菌分别与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、假单胞菌属的地中海假单胞菌（Pseudomonas mediterranea）聚到一起，相似度均高于99%。
关键词：地黄；连作障碍；固氮；耐酚酸；短小芽孢杆菌；地中海假单胞菌
中图分类号： S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0229-03
连作障碍指的是同种或同类植物在同一田地连年种植所造成的植物生长受阻、病虫害增加、质量产量严重下滑的现象。蔬菜、水果及中药材等植物種植过程中都存在不同程度的连作障碍问题[1-3]。其中，药用植物的连作障碍问题尤其突出。调查显示，约70%的药用植物因发生连作障碍而导致减产和质量下降[3]，这制约了中药资源的开发应用及中药产业的发展。
地黄是一种重要的传统中药，在我国医学药典中占有重要的地位。它具有清热凉血、益阴生津等功效。近年来的研究表明，地黄抽提物具有抗肿瘤、抗炎、调整机体稳态等多重功能[4-5]，这为其临床上的大量应用赋予了很好的科学解释，同时，也使其蕴含巨大的经济价值。但是，地黄的连作障碍极为严重，在同一块土地上2次种植地黄的时间间隔需达到 8～10年，否则其作为主要药用部分的块根将无法膨大，最终导致减产甚至绝收[3]。
研究表明，植物的连作障碍主要有以下3个方面的原因：酚酸类物质所导致的化感自毒作用、土壤中营养成分（尤其是氮、磷、钾类）的不平衡性和不可利用性、土壤微生物生态的失衡[6]。针对以上3种原因开发相关的技术方法克服植物连作障碍是可行的。已有研究指出，单纯地通过化学方法消除化感自毒作用，增加土壤养分并不能有效地解决连作障碍[7]。微生物菌剂往往具有多重复合功效，比如，降解土壤中的有毒有害物质，增加作物对氮、磷、钾等元素的吸收，改善植物根际微生物群落组成，安全环保等。因此，筛选有益微生物，制备能缓解植物连作障碍的微生物菌剂已成为目前的一个研究热点。
本研究选择连作地黄的根际土壤，对其所含固氮微生物进行阿须贝无氮培养基平板分离，获得多个细菌克隆。经多次分离纯化，最终获得2株固氮菌，并证实这2株菌能够耐受对羟基苯甲酸——地黄根际土壤中一种重要的一元酚酸类化感物质[8]。通过生理生化分析、16S rRNA测序及遗传进化树的构建，初步确定这2株菌分别属于芽孢杆菌属、假单胞菌属。
1材料与方法
1.1固氮菌的分离、纯化
连作地黄根际土壤，取自地黄道地产区河南省焦作市温县赵堡镇。土壤样品装入无菌样品袋中，放于冰盒内带回实验室，保存于4 ℃冰箱内。取10 g土壤加入装有100 mL无菌水和无菌玻璃珠的三角瓶中，置于28 ℃、200 r/min摇床上 30 min。取100 μL土壤悬液，梯度稀释，然后将稀释过的菌液（80 μL）涂布在阿须贝无氮培养基平板上并标记，置于 28 ℃ 恒温培养箱中，3 d后，选择菌落生长状态良好的平板，挑取菌落，进一步划线纯化。
1.2菌株的生理生化测定
淀粉水解试验、甲基红试验、伏普二氏试验（V.P试验）、吲哚试验均参照《微生物学实验》进行[9]。
1.3菌株的酚酸耐受能力检测
本研究选用酚酸类物质中的对羟基苯甲酸进行试验，检测其对固氮菌生长的影响。制备含不同浓度（0、125、250、500 mg/L）对羟基苯甲酸的液态阿须贝无氮培养基，分装到相应标记的试管中（5 mL/支），121 ℃、20 min高压蒸汽灭菌。然后将分离纯化的固氮菌分别接入对应浓度的试管中，每个浓度设置3个平行，置于28 ℃、200 r/min的摇床上，4 d后，测定不同试管中菌液的D600 nm，评估菌株的耐受能力。
1.416S rRNA测序及分析
参考文献[10]中的做法，提取纯化菌株的DNA。采用16S rRNA 通用引物27F：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 进行PCR 扩增[11]。将扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用Blast将所得16S rRNA基因序列与EzBioCloud数据库中的序列进行比对分析。通过MEGA 4.1软件，应用邻近（NJ）法构建系统进化树，确定所得菌株的分类地位。
2结果与分析
2.1固氮菌的分离与纯化
土壤样品经梯度稀释并涂布于阿须贝无氮培养基上培养3 d后，可看到有多个菌落产生。挑取平板上长势良好的18个菌落进行克隆，进行多次划线分离纯化，进一步筛选得到2株菌落形态特征鲜明的固氮菌，编号是7号和12号。其中，7号菌形成湿润、边缘光滑、较大的橘黄色菌落；12号菌形成边缘光滑、较小的乳白色菌落。
2.22株固氮菌的酚酸耐受能力
对羟基苯甲酸是酚酸类物质的代表之一。为了检测2株固氮菌的酚酸耐受能力，将2株菌分别接入加有不同浓度对羟基苯甲酸的阿须贝液体培养基中，4 d后测定菌液D600 nm。如图1所示，在125、250 mg/L对羟基苯甲酸浓度下，2株固氮菌生长速度均高于对照组（0 mg/L），7号菌液的D600 nm分别是对照组的2.78、1.93倍，12号菌液的D600 nm分别是对照组的3.66、4.66倍，且7号菌在125 mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好，而12号菌在250 mg/L对羟基苯甲酸的浓度下生长情况最好。进一步分析发现，这2株菌在 500 mg/L 酚酸培养基中的生长速度均低于对照组。这些结果表明，在一定浓度范围内，对羟基苯甲酸能够促进这2株菌生长繁殖，但是，过高浓度的对羟基苯甲酸会对这2株菌的生长繁殖造成一定程度的抑制作用。已有研究表明，一些从土壤中分离获得的微生物，如假单胞菌、芽孢杆菌等可以利用酚酸作为碳源和能量[12]，在限制性条件下，酚酸甚至可为固氮菌提供碳源[13]。因此，7号菌和12号菌极有可能通过利用对羟基苯甲酸作为碳源完成对对羟基苯甲酸的降解进而产生耐受性，实现自身的生长繁殖。
2.32株固氮菌的生理生化分析
由图2可知，淀粉水解试验中，2株固氮菌都能产生水解圈（箭头所指），表明它们均能不同程度地产生淀粉水解酶，其中7号菌产生能力较弱。甲基红试验中，2株菌在葡萄糖蛋白胨液体培养基中生长后，将甲基红加入试管内，均出现黄色阴性反应（箭头所指），说明这2株菌产生的酸性物质较少。V.P试验中，2株菌置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，取 2 mL 培养液，加入等体积的V.P试剂，充分振荡后置于37 ℃温箱中30 min，观察到培养液变红，均呈强阳性反应（箭头所指），且7号菌比12号菌反应明显，这表明2株固氮菌能将葡萄糖分解成丙酮酸并进一步脱羧、氧化生成二乙酰。吲哚试验结果表明，2株固氮菌均能产生吲哚分解蛋白胨中的色氨酸，产生红色的玫瑰吲哚（箭头所指），其中，12号菌产生能力稍弱。
2.4菌株的16S rRNA基因测序及遗传进化关系分析
为了进一步确定这2株菌的分类地位，采用16S rRNA 通用引物进行PCR 扩增和测序，所得结果在EzBioCloud数据库进行Blast比对，并利用MEGA 4.1构建系统发育树对2株菌与序列同源性菌株的亲缘关系进行分析。Blast比对结果显示，12号菌与假单胞菌属的地中海假单胞菌（P.mediterranea）的相似度达到99.56%，7号菌与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌（B.pumilus）的相似度达到99.78%。由图3可知，12号菌与假单胞菌属的地中海假单胞菌（P.mediterranea）聚到一起，两者具有密切的亲缘关系；7号菌与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌（B.pumilus）聚到一起，两者具有密切的亲缘关系。
3结论与讨论
地黄作为一种传统的中药材，具有很高的经济效益，但是却存在严重的连作障碍。一个普遍的观点是：酚酸类物质所导致的化感自毒作用、土壤中营养成分（尤其是氮、磷、钾）的不平衡性和不可利用性、土壤微生物生态的失衡是植物连作障碍的3个最关键因素。本研究从连作地黄土壤中筛选获得了2株既具有固氮能力又具有耐酚酸特性的高活性菌株，它们[CM（25]分别与芽孢杆菌属的短小芽孢杆菌、假单胞菌属的地中海
[FL（2K2]假单胞菌具有极为密切的亲缘关系。
Lise等于2000年的报道中显示，短小芽孢杆菌具有降解酚酸类物质的fdc基因[14]。最新的研究显示，短小芽孢杆菌菌株S1r1能够通过固氮及参与氮的重吸收，提高玉米的产量和质量[15]。假单胞菌属的地中海假单胞菌是2002年被报道的1个新种，目前，其在降解酚酸类物质及固氮方面的研究尚未见报道。尽管如此，假单胞菌属被认为普遍存在于自然界中，具有多种代谢功能，是多种污染物（如酚酸和多环芳烃类）降解的关键微生物[16]。Narbad等早在1998年就报道来自土壤中的荧光假单胞菌（P.fluorescens）菌株AN103具有一系列的酶系统能够对酚酸物质中的阿魏酸进行侧链剪切，从而以阿魏酸作为唯一碳源进行生长[17]。另外，燕永亮等报道，假单胞菌属中的斯氏假单胞菌（P.stutzeri）具有固氮酶基因，能够固定氮气为植物可利用的氨[18]。因此，12号菌株可能同时具有酚酸类物质降解基因和固氮酶基因。考虑到筛选所得的7号菌和12号菌所兼有的固氮和耐酚酸能力，以两者为基础研发的微生物菌剂将有助于改善土壤肥力，维持健康的土壤菌落组成，对于缓解地黄以及其他植物的连作障碍具有潜在的应用价值。
參考文獻：
[1]王喜枝，姚丽娟，王艳丽，等. 不同连作年限对大蒜根际土壤养分含量/微生物数量及酶活性的影响[J]. 河南农业科学，2016，45（9）：58-63.
[2]张爱君，张明普，张洪源. 果树苗圃土壤连作障碍的研究初报[J]. 南京农业大学学报，2002，25（1）：19-22.
[3]Zhang Z Y，Lin W X，Yang Y H，et al. Effects of consecutively monocultured Rehmannia glutinosa L. on diversity of fungal community in rhizospheric soil[J]. Agricultural Sciences in China，2011，10（9）：1374-1384.
[4]Lim J D，Yun S J，Chung I M，et al. Resveratrol synthase transgene expression and accumulation of resveratrol glycoside in Rehmannia glutinosa[J]. Molecular Breeding，2005，16（3）：219-233.
[5]Zhang R X，Li M X，Jia Z P. Rehmanniaea：review of botany，chemistry and pharmacology[J]. Journal of Ethnopharmacology，2008，117（2）：199-214.
[6]Wu L K，Li Z F，Li J，et al. Assessment of shifts in microbial community structure and catabolic diversity in response to Rehmannia glutinosa monoculture[J]. Applied Soil Ecology，2013，67（5）：1-9.
[7]Xie X G，Dai C C. Biodegradation of a model allelochemical cinnamic acid by a novel endophytic fungus Phomopsis liquidambari[J]. International Biodeterioration & Biodegradation，2015，104：498-507.
[8]谢星东.酚酸类物质的化感作用研究进展[J]. 生态学报，2014，34（22）：6417-6428.
[9]赵斌，何绍江. 微生物学实验[M].北京：中国科学出版社，2002.
[10]Stahl D A，Flesher B，Mansfield H R，et al. Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology[J]. Applied and Environmental Microbiology，1988，54（5）：1079-1084.
[11]Yang Q，Zhang J，Zhu K，et al. Influence of oxytetracyc-line on the structure and activity of microbial community in wheat rhizosphere soil[J]. Journal of Environmentan Sciences，2009，21（7）：954-959.
[12]Kefeli V I，Kalevitch V，Borsari B. Phenolic cycle in plants and environment[J]. Journal of Cell Molecular Biology，2003，2（1）：13-18.
[13]Chan Y K. Utilization of simple phenolics for dinitrogen fixation by soil diazotrophic bacteria[J]. Plant and Soil，1986，90（1/2/3）：141-150.
[14]Lise B，Charles D，Cavin J F. Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from lactobacillus plantarum reveals the existence of two other inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（8）：3368-3375.
[15]Kuan K B，Othman R，Rahim K A. Plant growth-promoting rhizobacteria inoculation to enhance vegetative growth，nitrogen fixation and nitrogen remobilisation of maize under greenhouse conditions[J]. PLoS One，2016，11（3）：1-19.
[16]Mulet M，David Z，Nogales B，et al. Pseudomonas diversity in crude-oil-contaminated intertidal sand samples obtained after the prestige oil spill[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（3）：1076-1085.
[17]Narbad A，Gasson M J. Metabolism of ferulic acid via vanillin using a novel CoA-dependent pathway in a newly-isolated strain of Pseudomonas fluorescens[J]. Microbiology，1998，144 （5）：1397-1405.
[18]燕永亮，楊劍，窦岳坦，等. 固氮斯氏假单胞菌全基因组测序和表达谱初步分析[C]//首届全国微生物基因组学学术研讨会会程与论文摘要集. 武汉：华中农业大学出版社，2006：54-56.
