对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.0、0. 5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于50 mL容量瓶中，定容得一系列对照品溶液。分别吸取对照品溶液2 mL于具塞试管中，依次加入5.0%重蒸苯酚溶液1.00 mL，摇匀，加入浓硫酸5.0 mL，在沸水浴加热5 min，室温静置10 min，测定490 nm处的吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=12.24x-0.003，r2=0.998，线性范围为0.01～0.05 mg/mL。
1.2.2.2 多糖含量测定 将提取或醇沉所得的多糖溶液均浓缩、定容至100 mL，取待测液2 mL稀释至50 mL，取稀释后的溶液2 mL于具塞试管中，按“1.2.2.1”节的方法测定多糖含量。
1.2.2.3 多糖得率与收率计算
1.2.3 多糖提取工艺优化
1.2.3.1 单因素试验 称取10.0 g处理后的川木瓜粉末5份，在料液比为1 g ∶20 mL，水浴提取温度90 ℃，水浴提取时间1.5 h的固定条件下，改变超声波时间20、30、40、50、60 min，考察超声时间对多糖得率的影响。按料液比（g ∶mL）1 ∶10、1 ∶15、l ∶20、1 ∶25、1 ∶30加入蒸馏水，超声时间40 min，浸提温度90 ℃，提取时间1.5 h，考察料液比对多糖得率的影响。在料液比为1 g ∶20 mL，超声时间40 min，提取时间1.5 h的固定条件下，改变浸提温度60、70、80、90、100 ℃，考察浸提温度对多糖得率的影响。在料液比为1 g ∶20 mL，超声时间40 min，提取温度90 ℃的固定条件下，改变浸提时间0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察浸提时间对多糖得率的影响。
1.2.3.2 正交试验 根据单因素试验结果，选取超声波处理时间、料液比、浸提温度、浸提时间为考察因素，以多糖得率为指标，进行L9（34）正交试验，优化川木瓜多糖提取工艺。正交试验因素水平设置见表1。
1.2.4 多糖醇沉工艺优化
1.2.4.1 单因素试验 取5份等体积的多糖提取液，分别加入4倍用量体积分数分别为55、65、75、85、95%的乙醇，在室温下沉降10 h，考察浓缩比对多糖沉降率的影响。固定乙醇体积分数为85%，醇沉时间为10 h，改变乙醇用量1、2、3、4、5倍，考察乙醇用量对多糖沉降率的影响。固定乙醇体积分数为85%，乙醇用量为4倍，改变醇沉时间5、10、15、20、25 h，考察醇沉时间对多糖沉降率的影响。
1.2.4.2 正交试验 根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、乙醇用量、醇沉时间为考察因素，以多糖沉降率为考察指标，进行L9（34）正交试验，优化多糖醇沉工艺。因素水平设置见表2。
2 结果与分析
2.1 多糖提取工艺结果
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 超声时间对多糖提取的影响 由图1可知多糖得率与超声时间呈正相关性，超声时间超过40 min后得率增加幅度较小。超声时间长有利于原料药材细胞破壁，多糖溶出。综合考虑提取效果与超声能耗，选取40 min为超声前处理时间。
2.1.1.2 料液比对多糖提取的影响 由图2可知，料液比（g ∶mL）在（1 ∶10）～（1 ∶20） 范围内多糖得率呈上升趋势，达 1 ∶20 时得率最高，（1 ∶20）～（1 ∶30）呈缓慢下降趋势。提取溶剂少使药材与溶剂接触不充分，多糖得率低；提取溶剂太多，会增加后期浓缩的困难，故料液比为1 ∶20比较适宜。
2.1.1.3 浸提温度对多糖提取的影响 浸提温度对多糖得率的影响如图3所示，由图3可知，在提取温度为60～90 ℃多糖得率随着提取温度升高而增加，90 ℃后提取率略下降。提取温度低，溶剂的渗透力差，多糖的溶解度小，不利于有效成分的溶出；温度过高可能会导致多糖降解，提取率反而降低[10]。因此，提取温度90 ℃时为宜。
2.1.1.4 浸提时间对多糖提取的影响 从图4可知，多糖得率随时间的延长先增加，随后又略有下降，提取时间为1.5 h时，多糖得率达最大值。提取时间太短不利于多糖的溶出，时间太长可能导致长时间高温，多糖被破坏。因此，提取时间选取1.5 h。
2.1.2 正交试验 正交试验结果如表3所示。从表3分析可知，提取川木瓜多糖各因素对多糖得率的影响顺序为B>D>A>C，即料液比>浸提时间> 超声时间>浸提温度；最优水平是A2B2C3D3，即提取多糖的最佳工艺为：超声时间 50 min，料液比1 g ∶20 mL，浸提温度100 ℃，浸提时间2.0 h。
2.1.3 提取工艺验证试验 取川木瓜粉末5份，每份10 g，
2.2 醇沉工艺结果
2.2.1 单因素试验
2.2.1.1 乙醇体积分数对多糖醇沉的影响 从图5可知，乙醇体积分数对醇沉率影响较大，最佳的乙醇体积分数为85%。多糖分子量分布较广，分子量与溶解性密切相关，不同分子量的多糖在乙醇中的溶出特性不同，在醇沉中会造成不同程度的损失。
2.2.1.2 乙醇用量对多糖醇沉的影响 从图6可知，多糖的沉降率随着乙醇用量的增加而增加，当乙醇用量为浓缩液的4倍时沉降率达最高大值，最佳的乙醇用量为4倍体积。
2.2.1.3 醇沉时间对多糖醇沉的影响 从图7可知，延长时间有利于多糖沉降，当沉降时间为10 h时多糖沉降率达85%，10 h后沉降率呈缓慢上升趋势，因此，沉降时间为10 h合适。
2.2.2 正交试验 醇沉工艺正交试验和直观分析结果如表4所示。从表4分析可知，各因素对多糖醇沉率的影响顺序为B>A>C，即乙醇用量>乙醇浓度> 醇沉时间；最优水平是A2B3C2，即醇沉多糖的最佳工艺为：乙醇体积分数85%，乙醇用量5倍，醇沉时间20 h。
3 讨论
天然活性多糖的提取和纯化方法对多糖的结构与生理活性有着重要的影响，如何高效地提取和纯化多糖是多糖研究的基础[11]。常见的多糖提取方法主要有溶剂提取法、超声波提取法、酶解法、微波提取法和超临界提取法，几种提取方法各有利弊，将几种方法联合使用可以明显提高提取效率。本试验将超声波与传统的水提法联合提取多糖，多糖得率可达4%以上。乙醇沉淀多糖的原理为利用乙醇降低多糖溶液的介电常数，破坏多糖分子的水膜，从而增加多糖分子间的相互作用，导致多糖溶解度降低而沉淀[12]。通过单因素和正交试验优化醇沉工艺，其沉降率可达90%以上；但在多糖醇沉过
程中大分子蛋白质、核酸等可能也会随之沉淀，后期应进一步除去非糖组分，纯化多糖，获得高纯度的活性多糖。
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