摘要:采用超声波和微波技术提取大火草[Anemone tomentosa(Maxim.)Péi]根､茎､叶中的多糖,确定超声波醇提为最佳提取方法,用苯酚-硫酸法测定其多糖含量｡通过单因素试验和响应面分析法,研究了料液比､温度､提取时间对多糖提取率的影响｡结果表明,提取时间和温度是影响大火草多糖提取率的主要因素,试验稳定性､精密度良好,提取大火草多糖的最佳条件为温度80 ℃,提取时间50 min,料液比1∶100(m∶V)｡利用最佳提取工艺得到根､茎､叶中的多糖含量分别为5.16%､1.61%､7.16%｡
关键字:大火草[Anemone tomentosa(Maxim.) Péi];多糖;响应面分析法
中图分类号:Q949.95文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2616-04
Optimizing the Process of Extracting Polysaccharides from Anemoen tomentose(Maxim.) Péi by Response Surface Methodology
BEI Zhan-lin,ZHANG Xin,CAO Jun-mai,LEI Qian,XIE Xing
(Department of Biological Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China)
Abstract: The polysaccharides were extracted from the roots, stems and leaves of Anemone tomentosa(Maxim.) Péi with ultrasonic and microwave extraction. The ultrasound-assisted extraction with ethanol was the best method. Polysaccharides were measured by phenol-sulfuric acid method. The effects of material-liquid ratio, extraction temperature and time on the extraction of polysaccharides were studied with single-factor experiment and response surface methodology. The results showed that the temperature and the time were the main factors. The optimal condition of polysaccharides extraction was temperature of 80 ℃,extraction time of 50 min, material-liquid ratio of 1∶100(m∶V). Under the optimal conditions, the contents of polysaccharides in roots, stems and the leaves were 5.16%,1.61% and 7.16%,respectively.
Key words: Anemone tomentosa(Maxim.)Péi;polysaccharides;response surface methodology
收稿日期:2013-12-13
基金项目:国家民委生态系统模型及应用重点实验室项目(2010SY08)
作者简介:贝盏临(1975-),男,宁夏盐地人,讲师,硕士,主要从事普通生物学教学与科研工作,(电话)0951-2067893(电子信箱)
realpal00147@163.com｡
大火草[Anemone tomentosa (Maxim.) Péi]为银莲花属植物,具有很高的观赏价值和抗炎活性等药用价值[1,2]｡银莲花属植物具有抗肿瘤､抗炎､解热镇痛､抗惊厥等各种作用,尤其是治疗前列腺和抗癌活性显著[3,4],所以大火草的开发意义重大｡本试验通过对大火草不同部位多糖含量的测定,旨在找出其最佳提取工艺和多糖含量较为多的提取部位[5-7],为今后开发大火草提供参考依据｡
1材料与方法
1.1材料
大火草:根､茎､叶均采于六盘山｡
1.2试剂和仪器
95%乙醇､无水乙醇(北京北化精细化学品有限责任公司),苯酚､浓硫酸(北京化学试剂公司),丙酮(富宇精细化工有限公司),正丁醇(天津市化学试剂六厂分厂),石油醚(天津市科密欧化学试剂有限公司),三氯甲烷(莱阳市双双化工有限公司),以上试剂均为分析纯;一级水(EASY pure型纯水器纯化)｡
低速台式大容量离心机(TDL-40B型,上海安亭科学仪器厂)､紫外可见分光光度计(UV765型,上海精密科学仪器有限公司)､数显恒温水浴锅(HH-2型,国华电器有限公司)､高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)､超生清洗器(KQ-500B型,昆山市超声仪器有限公司)､微波炉WD700(MG-5061T1型,天津乐金电子电器有限公司)､Vortex振荡器(QL-901型,其林贝尔仪器制造公司)､旋转蒸发仪(RE-52AA型,上海亚荣生化仪器厂)｡
1.3方法
1.3.1材料前处理将大火草的根､茎､叶干样粉碎,置于干燥箱中110 ℃恒温干燥15 min,称取根､茎､叶粉末各15 g,分别加入石油醚100 mL,采用索式回流脱脂､脱色1 h,通风橱中挥发石油醚;再用无水乙醇200 mL回流提取4 h,脱去醇溶性杂质和色素;之后将各部位粉末用无水乙醇冲洗,干燥至恒重备用｡
1.3.2标准曲线的绘制配制葡萄糖标准品,其浓度分别为0､0.01､0.03､0.05､0.07､0.10 mg/mL,在450~750 nm波长范围内进行扫描,检测最大吸收峰波长为490 nm｡在490 nm波长下测定葡萄糖的吸光度,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线｡
1.3.3不同方法提取大火草多糖称取前处理后的样品0.1 g,分别置于4个小烧杯中,采用超声波水提､超声波乙醇提取､微波水提､微波乙醇提取4种方法提取｡微波提取:分别用去离子水和80%乙醇以1∶100(m∶V,下同)料液比在微波炉中微波提取10 min｡超声波提取:分别用去离子水和80%乙醇以1∶100料液比在超声波清洗仪里80 ℃超声10 min｡之后将4种提取液在4 000 r/min离心10 min取上清,加4倍量的95%乙醇至溶液乙醇体积分数为80%,醇沉后4 000 r/min离心10 min得到沉淀｡沉淀用适量乙醇洗涤,再用去离子水溶解后离心去除不溶于水的杂质,定容至100 mL｡
采用苯酚-硫酸法测定吸光度[8,9]:取上述4种提取液各1 mL,加入0.5 mL 9%苯酚溶液,缓慢加入2 mL浓硫酸｡剧烈振荡5 min,水浴加热15 min后冰浴30 min,在波长490 nm下以去离子水为对照测定其吸光度,以下均采用此步骤测定吸光度｡确定出最佳提取方法,再利用最佳提取方法进行工艺优化｡
1.4最佳工艺的优化
1.4.1单因素试验称取材料0.1 g,提取后于波长490 nm处测定其吸光度｡采用苯酚-硫酸法测定各试验处理液的吸光度,并比较各个条件下的提取效果｡
1)温度对大火草多糖提取率的影响｡料液比 1∶40,超声提取时间为20 min,分别在40､50､60､70､80 ℃条件下提取多糖,将提取液稀释至接近透明(50倍左右)｡
2)提取时间对大火草多糖提取率的影响｡水浴温度为80 ℃,料液比1∶40的条件下,分别提取10､20､30､40､50 min,将提取液稀释后进行测定｡
3)料液比对大火草多糖提取率的影响｡温度为80 ℃,提取时间为30 min的条件下,分别以1∶20､1∶30､1∶40､1∶60､1∶80､1∶100的料液比提取多糖,将提取液稀释后进行测定｡
1.4.2应用响应面分析法优化超声波提取工艺响应面分析法是将体系的响应(如萃取化学中的萃取率)作为一个或多个因素(如萃取剂浓度､酸度等)的函数,运用图形技术将这种函数关系显示出来,选择试验设计中的最优化条件｡采用Design-Expert.8.05 b响应面优化分析软件进行数据分析,因素和水平见表1｡运用所得最佳工艺分别提取大火草根､茎､叶中多糖并比较其含量｡
2结果与分析
2.1标准曲线的绘制
在490 nm波长下测定葡萄糖的吸光度,以萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图1),得到的回归方程为y=8.792 3x-0.015 5,R2=0.997 8,线性关系较好,可用来计算多糖的含量｡
2.2提取方法的比较
采用超声波水提､超声波乙醇提取､微波水提､微波乙醇提取4种方法提取大火草中的多糖,其OD490 nm分别为0.141 1､0.288 3､0.031 1､0.146 6,其中超声波乙醇提取法的OD490 nm最大,所以选择此方法作为提取大火草中多糖的方法｡
2.3单因素试验结果
2.3.1温度对大火草多糖提取率的影响在料液比1∶40,超声波提取时间为20 min的条件下,改变提取温度提取大火草多糖,在490 nm波长下测定其吸光度,结果见图2｡由图2可知,大火草多糖提取的最适宜温度为60~80 ℃｡
2.3.2提取时间对大火草多糖提取率的影响 在水浴温度为80 ℃,料液比1∶40的条件下,不同的超声波提取时间对大火草多糖提取率的影响结果见图3｡由图3可知,大火草多糖的提取时间选择30~50 min为宜｡
2.3.3料液比对大火草多糖提取率的影响温度为80 ℃,提取时间为30 min的条件下,改变乙醇的添加量,提取大火草中的多糖,结果见图4｡由图4可知,最适宜料液比为1∶100｡
2.4稳定性试验
取葡萄糖标准液0.5 mL,置于10 mL容量瓶中,按照“1.3”中的方法,每隔0.5 h测定溶液吸光度,连续4 h,结果其吸光度基本无变化,样品溶液的稳定性良好｡
2.5精密度试验
吸取标准品溶液(0.03 mg/mL)6份,按照苯酚-硫酸法进行处理,得到溶液的吸光度分别为0.262 5､0.262 3､0.261 8､0.263 8､0.262 1､0.259 6,求得RSD为5.12%｡说明试验精密度良好｡
2.6响应面分析法结果
根据Design-Expert.8.05b软件分析各因素对大火草多糖提取率的影响,其中中间的等高线的斜率越大证明其对提取率的影响越大,得到各因素对提取率的影响大小顺序为提取时间､温度､料液比(图5)｡
当一个因素的值一定时,另外两个因素通过响应面分析可以得到其影响的大小,结果如图6､图7､图8所示｡对料液比､温度､提取时间进行变换,A=(a-100)/10,B=(T-70)/10,C=(t-40)/10(a为实际料液比中的液体值;T为实际提取温度;t为实际提取时间),以3次单因素试验所得的多糖提取率的平均值为响应值,试验结果见表2,其中1~12号是析因试验,13~16号是中心试验｡响应面分析结果表明,选择1号的组合为最佳组合,即料液比1∶100､温度80 ℃､提取时间50 min｡
称取100 mg大火草原料,根据最佳工艺条件温度80 ℃,料液比1∶100,提取时间50 min提取大火草根､茎､叶3个部位的多糖,进行3个平行试验,定容至100 mL后测定其吸光度｡大火草根部OD490 nm分别为0.438 2､0.438 5､0.437 5,茎部OD490 nm分别为0.265 7､0.126 3､0.127 2,叶部分别为0.613 7､0.604 9､0.612 5｡根据葡萄糖标准曲线可得到:大火草根､茎､叶的多糖平均含量分别为5.16%､1.61%､7.16%｡
3小结与讨论
在微波乙醇提取､微波水提､超声波乙醇提取､超声波水提4种提取方法中,超声波乙醇提取法的提取效果较好,效率最高｡随着温度的升高,多糖提取率不断增大;随着料液比的增大,提取率呈上升趋势,因料液比越大,传质动力大,则提取得到的多糖越容易溶解,损失就越少;随着提取时间的增加,多糖提取率在10~30 min明显增加,30 min后随着提取时间的延长,提取率变化不大｡
苯酚-硫酸法虽然适合提取多糖,但只在一些特定的植物多糖提取中占有优势,而且在操作上还应严格控制酸度,因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂[10]｡对于传统方法提取时间长,提取溶剂用量多等缺点[11],本试验采用超声波和微波这种提取工艺进行比较｡研究表明,超声波乙醇提取法为提取大火草中多糖较好的方法｡对超声波乙醇提取法进行优化,结果表明,最优工艺为温度80 ℃,料液比1∶100,提取时间50 min｡采用最优方案测定大火草根､茎､叶多糖的平均含量分别为5.16%､1.61%､7.16%,其中叶中多糖含量最高｡
参考文献:
[1] 王俊儒,马建琪,彭树林,等.大火草化学成分及其拒食活性研究初报[J].西北植物学报,1998,18(4):643-644.
[2] 张祖帅.毛茛科大火草果实种子和发芽特性研究[J].山西水利,2008(6):31-32.
[3] 王莉,红梅.壮药大火草治疗慢性盆腔炎的临床应用[J].中国民族医药杂志,2007(12):18.
[4] 红梅.壮药大火草治疗泌尿系统感染的临床应用[J].中国民族医药杂志,2008(7):20.
[5] 张志良,瞿伟菁.植物生理学实验指导[M].高等教育出版社,2003.
[6] 孙卓然,刘圆,李晓云,等.石斛不同种､不同药用部位中多糖含量测定[J]. 时珍国医国药,2009,20(8):1886-1888.
[7] 王建壮,安洁,吕华冲.蛹虫草子实体中多糖含量测定方法的研究[J].中国现代药物应用,2008,2(15):19-20.
[8] 徐凌川.人工栽培泰山白首乌药材总多糖含量测定[J].山东中医杂志,2008,27(3):193-195.
[9] 丛媛媛,热娜•卡斯木,帕丽达•阿不力孜,等.新疆胀果甘草多糖的提取及其体外抗氧化活性[J].中药材,2009(9):32-33.
[10] 陈凤清,丛建民.甘草多糖超声提取工艺优化研究[J].中国酿造,2009(1):138-142.
[11] 李红,李炳奇,刘红,等.甘草渣中黄酮和多糖的提取及含量测定[J].中国食品添加剂,2006(6):197-203.
