(湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所/国家食用菌加工技术研发分中心，武汉430064)
摘要：以鄂柑1号为材料，采用Plackett－Burman(PB)和中心组合设计(Central Composite Design)对影响超声波辅助提取柑橘果皮总黄酮工艺操作的8个因素进行了筛选优化｡PB试验设计与统计学分析表明，提取温度､溶剂浓度和液料比是影响总黄酮得率的3个关键因素，并确定其他5个因素水平为超声波功率100W，超声波处理时间20 min， 提取次数2次，溶剂类型为乙醇，分级水平60目｡对3个关键因素进行中心组合设计，并经响应面法优化分析得到影响总黄酮得率的二阶模型｡结果表明，鄂柑1号果皮总黄酮得率大于6．2%的提取条件为提取温度54．8～58℃，溶剂体积分数40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g，并进行了验证｡
关键词：鄂柑1号；总黄酮；Plackett－Burman设计；中心组合设计；超声波；提取条件
中图分类号：S666；TS255．1文献标识码： B文章编号：0439－8114(2008)06－0704－05
Optimization of Extraction Technique of Flavonoids from Citrus Peel with Assistance of Ultrasonic
SHI De－fang，GAO Hong，CHENG Wei，HE Jian－jun，CHEN Yu－xia
(Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear－agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences /National R & D Subcenter for Edible Fungi Processing，Wuhan 430064， China)
Abstract： Using Egan No． 1 as material， Plackett－Burman (PB) design and Central Composite Design (CCD) were applied to screen and optimize influential factors for extraction process of total flavonoids from Egan No． 1 peel with assistance of ultrasonic． The extraction temperature， the ethanol concentrarion， the ratio of solvent to material， as three key factors， were found to significantly influence the yields of total flavonoids via PB design and the following statistic analysis， Other factors were as follows： ultrasonic power 100W， the extraction time 20min， extraction times 2， the kind of solvent ethanol， meshes 60．The quadratic model for three significant factors was established with the yields of total flavonoids as the target response by CCD design and response surface analysis． The optimum extraction conditions in which the yields were more than 6．2% were： temperature 54．8～58℃， ethanol concentration 40%～44．6%， and ratio of solvent to material 10～12．55 mL：1g， It was also verified experimentally．
Key words： Egan No．1； flavonoids； plackett－burman design； central composite design； ultrasonic，extracting
柑橘果皮含有丰富的总黄酮，不仅具有降血压､降血脂､扩张冠状动脉等作用，还具有抗氧化､镇咳､平喘､抗菌抗炎､增强免疫和抗肿瘤等药理活性[1]，作为保健品和药品具有广泛的应用前景[2，3]｡2007年全国柑橘种植面积达181．5万hm2，产量突破1 800万t，达到历史新高｡当前及今后急需开发新型有效的提取工艺来满足我国柑橘精深加工发展的需求｡鄂柑1号，又名金水柑，具湖北特色的优良品种，果色橙红光亮，汁多化渣，浓甜爽口，风味醇香，可溶性固形物含量12．4%～13．89%，维生素C含量为34．26～38．27 mg·100g－1，但对其深加工的研究还很少报道｡Plackett－Burman法在筛选试验重要因子方面最为有效和准确[4]，可大大减少优化过程考察的因素数和试验次数，节省大量人力､和时间｡中心组合设计(CCD)用于确定试验因素及其交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系[5]｡本研究采用响应面法对超声波辅助提取鄂柑1号果皮总黄酮工艺进行优化，首先采用Plackett－Burman设计，筛选出对提取工艺起显著作用的影响因素，再利用CCD响应面分析确定最佳提取条件，通过绘制等高线图可直观地反映出影响因素之间交互作用的显著程度｡
1材料与方法
1．1材料
鄂柑1号果皮(湖北省农业科学院果树茶叶研究所)，数控超声波清洗器(KQ－100DB型，昆山市超声仪器有限公司)，数显恒温三用水浴锅(金坛国瑞实验仪器厂)，紫外可见分光光度计(UV2600型，上海天美科学仪器有限公司)，旋转蒸发仪(RE－52型，上海亚荣生化仪器)，循环水式真空泵(SHZ－Ш开封宏兴科教仪器厂)，植物粉碎机(LG－500A型，瑞安百信药机械厂)，离心机(TDL－型，上海安亭科学仪器厂)，芦丁(上海生化制品厂)，其他试剂为AR级｡
1．2方法
1．2．1鄂柑1号果皮总黄酮的提取工艺流程鄂柑1号果皮→干燥(60℃，5 h)→粉碎→过筛分级(60､80目)→乙醇溶液振荡浸泡→超声波辅助回流提取→过滤→旋转蒸发浓缩→定容→定量分析；总黄酮得率的测定采用亚硝酸钠－硝酸铝比色法[6]
1．2．2试验设计[7，8]Plackett－Burman设计应用Design Expert软件对提取试验进行Plackett－Burman设计(因素水平设计见表1)｡对8个主要因素进行筛选：即提取时间､液料比､超声波功率､原料粒度的分级水平､提取次数､溶剂分数､溶剂类型､提取温度，外加3个虚拟变量｡每个变量分别确定(+)和(－)两个水平，以总黄酮得率为响应值，共进行12次试验以确定每个因素的影响因子｡
1．2．3响应面试验设计在确定了对响应值具有重要影响的因子后，采用中心组合设计(CCD)，对关键因子(提取温度､溶剂分数､液料比)进行进一步研究，每个因素取5个水平，根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程：
=β0+βixi+βijxixj+βijx2i
其中是预测响应值，xi是自变量，β0､βi､βii､βij是待估计参数偏移值｡分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求出最佳值｡诸因子水平及编码见表2｡
2结果与分析
2．1超声波提取工艺中影响因素的确定
提取工艺所涉及的原料粉碎度､所用溶剂以及溶剂分数､用量､辅助提取方式､提取温度及提取时间等因素都对提取效果有影响｡运用Plackett－Burman对诸因素进行分析，依据实际情况选取合适的因素水平，试验设计见表3，方差分析结果见表4｡
由表4可以看出，模型P为0．039 7<0．05，表明模型显著，在被研究的整个回归区域拟合很好｡由该方程的方差分析和复相关系数R=0．965 4，说明相关性较好，其中提取温度(x8)､溶剂分数(x6)､液料比(x2)是有意义的模型参数(P均小于0．05)，采用响应面分析法作进一步的研究｡据表4回归分析可知其他5个因素：提取时间､提取次数､分级水平取低水平，溶剂类型为乙醇，而超声波功率取高水平，有利于总黄酮得率提高｡提取的时间和次数的减少表明原料处于一定超声波功率作用下，有效成分提取得率趋向极限值，随着提取时间增长以及提取次数增加，使得提取物中的杂质增多，有效成分含量反而降低；丙酮作为提取剂效果不错，但成本和毒性较高[9]，乙醇浸提的选择性强，浸出率高，安全性好[10]；粒度分布越小与溶剂等接触面积大，有利于有效成分的梯度溶解；但是不能太细，否则影响过滤，造成生产效率低下和较大损耗，本文选用60目水平即可；因而确定其他5个因素水平依次为：超声波功率100W，超声波处理时间20 min，提取次数2次，溶剂类型为乙醇，分级水平60目｡
2．2CCD优化设计与响应面分析
中心组合设计及结果见表5｡试验数据使用软件进行二次回归拟合后，得到以下回归方程：
=5．05+0．18A－0．3B－0．2C－0．085A2+0．02B2+0．068C2－1．20AB+0．41AC+0．36BC
其中y､A､B､C分别代表总黄酮得率､提取温度､溶剂分数､液料比｡响应面分析中对试验结果进行拟和的二次模型方差分析见表6｡F值为4．93，多元相关系数为R=0．816，说明模型对实际情况拟合较好；P为0．010 1，表明该模型高度显著，可用来进行响应值预测｡二次模型中回归系数的显著性检验表明，溶剂分数对提取得率的线性效应显著，而提取温度和液料比不显著；3因素对提取得率的曲面效应不显著；提取温度和溶剂分数对提取得率的交互影响显著，而提取温度和液料比和溶剂分数和液料比的交互影响不显著｡图1､图2和图3是由多元回归方程式所做的响应曲面图及其等高线图｡由此可对两因素交互影响提取的总黄酮得率进行分析｡
图1显示了液料比在最佳值(10．35 mL∶1g)条件下，提取温度和溶剂分数对总黄酮得率的交互影响｡当溶剂分数处于低水平条件时(40%)，随着温度的升高，总黄酮得率出现上升趋势，而在溶剂分数处于高水平条件下(80%)，随着温度的升高，总黄酮得率反而出现降低｡这说明溶剂分数与提取温度之间存在显著的交互影响，不同比例的溶剂分数与提取温度组合，将出现不同的响应值变化趋势｡应综合考虑试剂成本和能耗的要求来确定合理的提取温度和液料比，才能获得较高的总黄酮得率｡
图2显示了溶剂分数处于最佳值(40．4%)时，提取温度和液料比对提取效果的交互影响｡从三维图中可以看出，两个因素的交互影响并不显著｡当提取温度处于高水平时，可以获得较高的总黄酮得率，且随着液料比的增大，总黄酮得率略有增加，但不明显，因此确定提取温度应为较高水平｡
图3显示了提取温度为最佳值(58℃)时，液料比和溶剂分数对提取效果的交互影响｡从图中看出，在试验水平范围内，溶剂分数处于低水平时可获得较高的总黄酮得率，而此时随液料比的增加，总黄酮得率略有下降，因此料液比应为较低水平｡
2．3模型对提取工艺参数的优化
通过回归模型来预测总黄酮得率高于6．3%的提取工艺参数为：提取温度54．8～58．9℃，溶剂分数40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g，优化出5组鄂柑果皮总黄酮提取工艺参数，并进行了验证(表7)｡
优化工艺中最佳实测值6．37%，与文献中报道超声波辅助提取的总黄酮得率5．56%相比提高了14．57%[11]｡表明了PB和CCD方法共同优化天然功能性成分提取工艺的可行性，优化后的工艺参数更有利于总黄酮物质的提取｡
2．4超声波辅助提取工艺对总黄酮得率的影响
提取次数､溶剂类型､分级水平相同的条件下，本试验确定的超声波辅助提取工艺(超声波功率100W，超声波处理时间20 min，提取温度58℃，溶剂分数40．4%，液料比10．35 mL∶1g)，与回流法优化的提取工艺(提取时间90 min､提取温度65℃､溶剂分数70%､液料比15 mL∶1g)所得总黄酮得率进行比较，所得结果(表8)说明，超声波辅助提取比回流提取的得率5．45%提高了16．8%，超声波辅助提取提高了黄酮物质得率｡
3结论
研究证明：①运用Plackett－Burman试验设计，从影响超声波辅助提取鄂柑总黄酮工艺过程的众多因子中高效地筛选出关键因素提取温度､溶剂分数､液料比｡其他因素水平依次为超声波功率100W，超声波处理时间20min，提取次数2次，溶剂类型为乙醇，分级水平60目｡②通过中心组合设计和响应面分析实现了提取工艺参数的合理优化，总黄酮得率大于6．2%最佳提取条件为提取温度54．8～58．9℃，溶剂分数40%～44．6%，液料比10～12．55 mL∶1g｡③提取得到的鄂柑总黄酮得率达到6．37%，缩短了提取时间，节约了提取溶剂｡超声波辅助提取过程中的空化效应使得液体中的微小泡核在声波作用下产生振荡､生长､收缩､崩溃等一系列刺激效应，加速了有效物质的释放扩散和溶剂渗透作用｡
参考文献：
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