摘 要 采用超声波破碎结合高效液相色谱技术，建立了定量检测质粒DNA的方法，测量结果可以溯源至核苷酸标准物质。采用超声波破碎（功率300 W，频率24 kHz）技术将质粒DNA破碎成200～500 bp的小片段DNA，再用蛇毒磷酸二酯酶将其水解为4种核苷酸（dCMP：3.2 min；dTMP：4.7 min；dGMP：5.3 min，dAMP：6.8 min），将产物通过HPLC分离后，采用外标法进行定量分析。应用此方法对待测质粒 pNK603进行定量分析，测定的4种核苷酸的摩尔百分比（A∶T＝0.95, C∶G＝0.98）与理论值接近。本方法的测定结果（47.24g/g）与实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR，45.98g/g）和PicoGreen 荧光染料法（46.02g/g）的测定结果没有显著差异，表明建立的超声波-HPLC方法可以应用于质粒DNA的定量分析。
关键词 质粒； 超声波破碎； 高效液相色谱； 荧光； 聚合酶链式反应
1 引 言
核酸是生物遗传信息的载体，对核酸的定量分析是解析核酸结构和功能的基础。目前定量分析核酸的方法根据其原理的不同分为两类：一类是直接定量检测核酸，主要是通过应用标记探针的杂交反应进行定量检测；另一类是将待测核酸扩增后，再通过酶免疫法（EIA）、发光分析、荧光分析等方法定量检测扩增产物，主要是定量聚合酶链式反应（PCR）技术。
在应用上述方法测定核酸含量时，其测量结果的溯源性、可比性还未引起关注。但是，在核酸标准物质制备过程中（如质粒分子标准物质），其核酸测量溯源的重要性就凸显出来。为了解决核酸定量测量的准确、溯源问题，各国都在进行探索。本研究试图通过色谱或质谱技术建立一个可溯源的高准确度的测量方法，即将双链的基因组或质粒核酸水解成单核苷酸，通过同位素稀释质谱法测定水解后的核苷酸的含量，据此计算核酸的浓度； 还可根据核酸序列信息及4种核苷酸的摩尔浓度检查核酸水解是否完全。应用这种方法测定的结果可以溯源到核苷酸标准品，从而解决核酸测量的溯源问题。
目前，应用同位素稀释质谱测定寡核苷酸（20 mer）浓度的方法已经比较成熟，但是对于双链，且长度大于几百个碱基对的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR和荧光染料法外，由于缺乏相应的标准品，还没有其它成功的方法可用。长片段核酸无法直接完全酶解，因此，建立一个可以将长片段核酸碎裂为小片段核酸进而可以完全水解的方法，是实现大片段核酸的色谱、质谱及毛细管电泳定量分析的关键。本实验的目的是以质粒DNA为分析对象，利用超声波破碎技术将其破碎成小片段DNA，通过优化条件使其破碎后的产物可以进行完全酶解，酶解产物利用高效液相色谱（HPLC） 进行定量分析，以期建立一个溯源链清晰，准确度高的核酸定量测量方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1200液相色谱仪（安捷伦中国有限公司）； 酶标仪（M200，TECAN）、荧光定量PCR仪（AB7900HT，美国ABI公司）； JY92ⅡD超声波破碎仪（南京新辰公司）。Taqman Universal MasterMix 试剂盒（4304437，美国ABI公司）；SB-AQ色谱柱（150 mm×4.6 mm，安捷伦中国有限公司）；特异性引物和探针（上海英俊公司合成），其中探针5′端采用荧光标记基团FAM进行标记，3′端采用荧光猝灭基团TAMRA进行标记。具体序列见表1。乙腈（色谱纯）、蛇毒磷酸二酯酶（SVP）、4种核苷酸标准品，均购自美国Sigma公司。
L SVP缓冲液，37 ℃酶解3 h，85 ℃酶解20 min。设置3个平行，分别以不加SVP和不加DNA样品为酶解样品的对照。同时将未经超声波处理的质粒 DNA直接进行酶解作为超声波处理样品的对照。
2.2.2 HPLC分析 将酶解后的样品经12000 g离心2 min，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC分析。流动相A：20 mmol/L醋酸铵（pH 3.5）；流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～5 min, 100% A；5～10 min, 90% A；10～20 min：90% A；20～25 min：100% A。流速：1 mL/mim，进样量20L。检测波长254 nm。
2.2.3 荧光定量PCR扩增及定量标准曲线的制作 为了与HPLC方法测定质粒浓度结果进行比较，将相同的质粒DNA样品进行荧光定量PCR扩增，测定其浓度。采用表1中的引物和优化的扩增体系 进行PCR扩增。扩增条件： 95 ℃， 5 min；45个循环： 95 ℃，15 s； 60 ℃，1 min。
标准曲线的制作：将质粒DNA用荧光染料法测定浓度后，梯度稀释成5个标准溶液，采用上述条件和体系进行扩增，以初始质粒标准溶液浓度的对数为横坐标，以扩增得到的Ct值为纵坐标作图。
拷贝数（L）与质量浓度（C）换算公式：L＝CDNA ×6.02×1023/（3301×660）
其中，CDNA为质粒浓度（g/L）；3301为质粒分子的碱基对个数；660为每个碱基对的平均分子量。
2.2.4 荧光染料法测定质粒DNA浓度 采用PicoGreen试剂盒法对待测质粒DNA样品进行浓度测定，具体方法见PicoGreen操作说明书。
3 结果与讨论
3.1 质粒DNA的超声波破碎
将质粒DNA进行超声波破碎处理后，采用2.5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。第7泳道为未经处理的质粒，1～6泳道依次为超声处理 10 min， 15 min， 20 min， marker，30 min和50 min。由此可见，超声波处理50 min后，质粒pNK603由原来的3.4 kbp破碎成了主带在200～500 bp的DNA片段。增加超声波处理功率，破碎结果没有明显差异。另外，通过胶回收测定超声波破碎效率，发现超声波破碎质粒DNA的最佳浓度为30～90g/g； 浓度大于200g/g，破碎的效率降至50%。
3.2 酶解及HPLC分离
将超声破碎后的DNA片段进行酶解，酶解后的产物经HPLC分离，分离结果见图2。图2a为4种核苷酸标准品的分离结果，根据出峰先后顺序，4个峰分别为dCMP （3.2 min），dTMP（4.7 min），dGMP（5.3 min）和dAMP（6.8 min）。图2b为质粒DNA破碎、酶解后产物的分离结果。质粒DNA经过超声波破碎和酶解后的产物为4种核苷酸， 图2 核苷酸标准品及质粒 pNK603水解产物的HPLC分离结果
Fig．2 Separation of standard nucleotides and hydrolyzed products of pNK603 by HPLC
（a）. 4种核苷酸标准品分离结果；（b）.超声波破碎处理质粒pNK603水解产物分离结果；（c）. 未经超声波处理质粒水解产物分离结果。 （a）. separation of standard nucleotides; （b）. hydrolyzed products of ultrasonic treated plasmid pNK603; （c）. hydrolyzed products of plasmid pNK603 without ultrasonic treat; the abscissa is retention time: min）且4种核苷酸在该实验条件下得到了理想的分离效果。图2c为没有经过超声波处理的质粒直接酶解后的产物分离结果，该结果与超声波处理后进行酶解的质粒DNA水解结果不同，未有发现 dTMP对应的吸收峰，而在保留时间为12.9， 18.7和22.2 min 处出现了新的吸收峰，这表明未经过超声波处理的质粒DNA直接进行酶解，没有完全水解。因此，超声波处理对质粒DNA的完全水解起关键作用，而质粒是否完全水解直接影响质粒DNA浓度的测定结果。
3.3 HPLC定量分析核苷酸
采用面积归一化法对超声处理的质粒DNA进行定量分析，4种核苷酸的标准曲线方程和线性相关系数见表2。4种核苷酸的标准曲线线性相关系数均大于0.99，可见4种核苷酸的浓度与其峰面积的线性相关性很好。根据标准曲线产生的标准方程对质粒DNA水解后的4种核苷酸进行定量分析。4种核苷酸的质量浓度之和，即待测质粒的浓度（47.24g/g）。测定的摩尔百分含量值与理论摩尔百分含量值非常接近。另外， 根据测定结果计算出的A:T（0.95）和C:G（0.98）的值与理论值1也很接近。
1 dcMP: Deoxycytidylic acid; dTMP: Thymidylic acid; dGMP： Doxyguanylic acid; dAMP: Deoxyadenylic acid.长片段、双链DNA只有完全水解成核苷酸后，利用HPLC进行定量分析的结果才能准确。未经超声波处理，直接进行磷酸二酯酶水解的质粒DNA， 从HPLC分离结果表明，DNA没有完全水解；而经过超声波处理后的质粒DNA，用磷酸二酯酶水解，水解后测定的A∶T和C∶G的值与理论值非常接近，表明超声波破碎后的DNA片段水解基本完全。
3.4 荧光定量PCR定量分析
采用荧光定量PCR对未经处理的质粒上的两个基因片段（ zSSIIb和NK603）进行定量分析。测定结果为1.27×1010拷贝/ L，换成质量浓度为45.98g/g。
3.5 3种方法比较
将3种方法测定质粒DNA浓度的结果进行比较，结果见表3。荧光定量PCR方法与PicoGreen方法的测定结果非常一致，而HPLC方法测定结果与之比较偏高。文献\报道，PicoGreen荧光染料法用于测定小于23 kbp的DNA片段的浓度时，其结果通常都偏低，原因是该方法基于荧光染料法定量，且依赖于试剂盒内的标准DNA，而这个标准DNA为
SymbollA@ -DNA，长度大于23 kbp，因此对于长度小于23 kbp的DNA，其与荧光染料的结合率低于
SymbollA@ -DNA。实时荧光定量PCR方法在建立定量标准曲线时， 对初始质粒pNK603浓度的测定也依赖于该试剂盒，所以荧光定量PCR方法与PicoGreen荧光染料法的测定结果均偏低。HPLC方法定量结果与实时荧光定量PCR和PicoGreen荧光染料法的测定结果无显著差异，从而证明超声波破碎作为将质粒等大片段DNA破碎成小片段DNA，进而采用HPLC方法定量的可行性。
此外，超声波-HPLC方法的相对标准偏差（RSD）为2.5%，优于其它两种方法。但是检出限和定量限远不如其它两种方法。超声波-HPLC法、PicoGreen染料法和荧光定量PCR法测定结果的合成相对不确定度分别为3.30%， 4.56%和2.46%（表3）。
建立的超声波破碎-HPLC方法实现了对核酸大分子物质的定量分析，测定结果溯源至核苷酸标准品，从而解决了核酸定量测定的溯源性问题。本方法与荧光定量PCR或荧光染料法相比，准确度相当，精密度略优，而且不需要价格昂贵的荧光探针或荧光染料等试剂。但是由于超声波-HPLC方法利用HPLC定量，受HPLC定量的灵敏度限制，本方法在测定低浓度DNA时存在局限。
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6 Detection of DNA Residue in Bioproduct by PicoGreen Assay（PicoGreen荧光法定量生物制品中DNA残留）. Available at htp://meeting.dxy.cn/luciferase/article/i10035.html
Abstract A new traceable DNA quantification method by HPLC with ultrasonic splitting was set up in this study and the measurement can be traceable to nucleotides. First, the large fragment of DNA such as plasmid DNA, was cut into 200－500 bp by ultrasonic （power at 300 W, frequency at 24 kHz） and then the products were hydrolyzed to four kinds of nucleotide （dCMP: 3.2 min; dTMP: 4.7 min; dGMP: 5.3 min; dAMP: 6.8 min） by snake venom phosphodiesterase. Finally, the hydrolyzed products were separated and quantified by HPLC. The mole percentage of each nucleotide in plasmid pNK603 measured by HPLC （A∶T＝0.95, C∶G＝0.98） was close to its corresponding theoretical value. Additionally, there was no significant difference among the results determined by ltrasonic-HPLC （47.24g/g）, real time PCR （45.98g/g） and PicoGreen kit （46.02g/g）. This indicates the technique of ultrasonic-HPLC can be successfully applied to plasmid DNA quantification.Keywords Plasmid; Ultrasonic splitting; High performance liquid chromatography; Real time polymeras chain reaction
（Received 4 January 2011; accepted 15 April 2011）
