[摘要]目的 采用超声波细胞仪破碎法与酶解法联合制备短刺小克银汉霉原生质体，提高原生质体的制备量。 方法 采用蜗牛酶将短刺小克银汉霉细胞壁消化，采用超声波细胞破碎仪机械破碎加速其原生质体的释放，得到符合实验要求的原生质体。 结果 通过正交实验优化得到制备短刺小克银汉霉原生质体的条件是：以0.6 mol/mL氯化钾作为渗透压稳定剂，以10 mg/mL蜗牛酶为酶解剂，选用菌龄为12 h的菌丝，在37℃下酶解2 h，最后使用超声波细胞破碎仪破碎菌丝体15 min。短刺小克银汉霉活性原生质体的释放量是7.5×10 7个/mL，且其7 d内的存活率维持在90%以上。 结论 超声波细胞仪破碎法和酶解法联合使用可有效提高短刺小克银汉霉原生质体的释放率和活性。
[关键词]短刺小克银汉霉；原生质体；超声波细胞仪破碎法；酶解法
[中图分类号] TQ920.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）03-
小克银汉霉（Cunninghamella）是一种丝状真菌，其属于接合菌门毛霉菌目，现已发现共有14个种，最主要特点在于其具有与人体肝脏类似的药物主要代谢酶—细胞色素P450酶（Cytochrome P450），可以对药物进行体外转化产生与哺乳动物相似的或者不同的代谢产物，现已证明其可以代谢的药物有91种之多[1]，因此，小克银汉霉可以作为药物研究中的模式代谢菌，用于体外生物转化药物直接产生活性产物，广泛应用于药理学、毒理学、工业生产等研究领域。但对毒性和难溶性药物的转化，却存在着转化率较低，转化时间长，产物单一等系列问题，分析其中主要原因在于，它本身存在的细胞壁阻碍了药物与酶的结合，大大降低了转化速率[2]。因此，采用一定工艺酶促降解其细胞壁，利用其原生质体直接转化药物是一种比较理想的方法。现已有报道采用研磨法、普通超声波法、酶解法制备原生质体，以酶解法为最好，得到的原生质体产率最高，活性较好[3]。Sedlaczek等[4]已成功运用蜗牛酶制得的原生质体将11-脱氧皮质醇转化率提高了40倍。
虽然酶解法可以获得较高产率的原生质体，但是裂解酶作用时间较长，长期使用也会对原生质体的活性产生影响，如果要得到产率高、产物丰富和活性更加好的原生质体则需要寻找更加有效的制备方法。而超声波细胞破碎仪在植物有效成分的提取[4]、加速天然产物生物转化[6-7]、组织蛋白提取[8]等方面的广泛运用给我们提供了很好的思路。酶解法旨在通过特异性的酶降解反应将细胞壁消化，而超声波细胞破碎仪则是利用超声波的空化作用，使空泡周围细胞的细胞壁击穿破碎，从而进一步将原生质体释放出来。我们推测两者联合使用，势必会提高原生质体的制备率和活力。本文采用蜗牛酶解法与超声波细胞仪破碎联合的方法制备原生质体，将产率提高了14倍，且在7天内的存活率维持在90%以上，现报道如下：
材料与方法
材料
1.1.1 菌种 短刺小克银汉霉AS 3.970购自中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心（CICC，菌种编号：40267）
1.1.2 试剂和仪器 试剂：蜗牛酶（上海生工，SB0870），荧光素二乙酸酯（上海生工，ZWY0014144），氯化钾（KCl）、硫酸镁（MgSO4）、甘露醇、葡萄糖，实验用水为超纯水。
仪器：恒温摇床（ZHWY-111B，上海智诚）；霉菌培养箱（MJP-150，上海精宏）；隔水式恒温培养箱（GNP-9080，上海精宏）；倒置显微镜（Nikon Te2000-u，日本）；光学正置显微镜（Nikon E200，日本）；超声波细胞破碎仪（MISONIX，宁波海曙科生超声设备有限公司）；高速冷冻离心机（5430R，Eppendorf中国有限公司）。
1.1.3 培养基 固体斜面培养基：采用土豆葡萄糖琼脂培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1000 mL）。液体培养基：采用土豆培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，自然pH）。
1.1.4 原生质体渗透压稳定液 由无菌水配制0.6 mol/L的KCl、MgSO4、甘露醇、葡萄糖渗透压稳定液。
1.1.5 酶液的配制 称取1 g蜗牛酶溶解于0.6 mol/L的渗透压稳定剂中，制得20 mg/mL的蜗牛酶母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌置于4℃冰箱中储存备用。使用时用相应的渗透压稳定剂稀释到所需浓度即可。
1.2 方法
1.2.2 原生质体的制备 称取按1.2.1方法所制得的菌丝体1 g，加入1 mL的酶液，置于37℃恒温培养箱酶解4小时后，加入20 mL渗透压稳定剂，7500 r/min 离心20 min。取沉淀加入30 mL稳定剂重新悬浮，在冰水中使用超声波细胞破碎仪进行破碎，时间为15min，振幅为10，每间隔1min运行30 s。破碎完成后，用300目过滤除去细胞壁碎片，再经4层擦镜纸进一步纯化，制得原生质体悬浮液。
1.2.3 原生质体的计数及活性检测 原生质体活力的评估采用FDA染色法。量取100 μL FDA储备液加入10 mL的渗透压稳定剂稀释成0.05%浓度的FDA染液。1 mL原生质体悬浮液加入200 μL的FDA染液，置于28℃恒温箱染色10 min后在倒置荧光显微镜下用血球计数板进行原生质体的计数及活性检测。
2 结果
2.2 优选制备原生质体的最佳渗透压稳定剂
2.3 正交试验优化确定原生质体制备最优条件
根据影响原生质体形成的四个关键因素：菌丝体的培养时间、蜗牛酶浓度、酶解时间及酶解温度，根据表2进行L9（34）正交设计实验，测定其对原生质体形成与活性的影响，结果见表3所示。由正交实验结果分析表4的极差R值可得知，影响原生质体释放因素的主次为B>C>A>D，通过P值分析可得最佳实验组合为A2B3C3D3，即当菌龄为24 h，蜗牛酶的浓度为20 mg/mL，酶解时间为12 h，酶解温度为37℃时，得到小克银汉霉原生质体的数目最多。从原生质体死亡率的正交试验结果分析（表5）可得到影响原生质体活性的影响因素主次为C>B>D>A，最佳实验组合为A1B2C1D3。酶解时间是影响原生质体活性的主要原因，随着酶解时间的延长，原生质体活性急剧下降，所以实验中应尽量减少酶解时间。原生质体的活性是小克银汉霉原生质体对底物进行生物转化的重要影响因素，因此选用制备原生质体的最优条件为A1B2C1D3。
2.5 原生质体酶解过程形态
3 讨论
超声波细胞破碎仪是利用一种超声波在液体中产生空化效应的多功能、多用途的仪器，它能用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎。本文采用蜗牛酶酶解法和超声波细胞破碎仪机械法联合运用制备原生质体，这与Xiong等[9]用单酶解法报道相比要高出14倍，这是没有报道过的。笔者推测其中的原因是虽然蜗牛酶在作用长达4 h后可得到大量小克银汉霉原生质体，但是不可回避的问题是蜗牛酶在降解细胞壁时，对原生质体活性有严重的损害，同时大量的具有代谢和转化药物的酶也同时有可能被降解，这可能是造成药物转化率低的主要原因。本文联合运用超声波细胞破碎仪机械法将蜗牛酶解4 h缩短到2 h，提高了原生质体的活性，且原生质体在7 d内的存活率达90%以上。由此推测联合使用蜗牛酶法和超声波细胞破碎仪机械法可使原生质体的活性提高，这是一种很有效的制备原生质体的方法。
现在检测原生质体活性方法主要是通过原生质体的再生率进行评估，这种方法需要将原生质体恢复成菌丝体，非常复杂耗时[10]。Rotman等[11]提出的FDA染色法是一种简单快速检测方法，FDA可以直接与活性原生质体的酯酶结合发出荧光后即可检测，而不用菌丝体，节省了大量的检测时间。虽然FDA广泛运用于植物原生质体的活性检测，但应用于微生物原生质体活性检测仍鲜有报道。本研究运用FDA染色法准确快速检测出具有活性的短刺小克银汉霉原生质体数量，并可随时监测其活性变化，为原生质体的活性评估提供了简单高效的方法。
本研究联合运用酶解法和超声波细胞破碎仪机械法，制备了高活性的原生质体，实验证明，此法高效、产率高、成本低。本研究为小克银汉霉原生质体制备提供了一种有效的方法。而对于短刺小克银汉霉原生质体的其他酶的活性测定及其对药物转化率的分析有待于我们课题组进一步深入探索研究。
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（收稿日期：2012-12-24）
