超声波辅助醇溶剂法提取橙皮苷及体外抑菌活性分析

材料与方法

1.1仪器与设备AUY220型电子分析天平，日本岛津股份有线公司；B220型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；DHG9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；UV752N紫型外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2材料与试剂新鲜柑橘，市售，取皮，置于70 ℃烘箱中干燥；橙皮苷标准品（分析纯），购于上海金穗生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制。精确称取橙皮苷标准品12 mg，用含0.1%NaOH的75%乙醇充分溶解且定容至50 ml，为溶液1。取30 ml溶液1，定容至50 ml，为溶液2；再取40 ml溶液2，定容至50 ml，为溶液3；然后取40 ml溶液3，定容至50 ml，为溶液4；取40 ml溶液4，定容至50 ml，为溶液5；最后配制成浓度为0.023 6～0.072 0 mg/ml的标准液。在362 nm处测定吸光值，并且绘制标准曲线，得到的回归方程为y=23.58x-0.209，R2=0.975。

1.3.2橙皮苷提取工艺流程及条件优化。橙皮苷的提取工艺流程见图1。按照该工艺流程固定固液比、乙醇浓度、提取时间、pH和乙醇浓度，分别研究各提取条件对橙皮苷提取率的影响。在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验，对料液比、乙醇浓度、pH和提取时间等因素对橙皮苷提取率的影响。

1.3.3橙皮苷含量及提取率的测定。取100～200 μl提取液于10 ml试管中，加入碱性乙醇溶液，定容至10 ml，测定样品，并且以碱性乙醇为空白，在362 nm处测定其吸光值。根据标准曲线方程，计算橙皮苷的含量、提取率。橙皮苷的提取率计算公式为：

X（%）=C×201 000×0.5×100%

式中，稀释后的橙皮苷溶液的浓度（μg/ml）。

1.4抑菌试验分别用PBS将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌配制成OD600为0.1的菌液。取0.2 ml大肠杆菌、金黄色葡萄球菌液，加入到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，立即用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。将浸渍过橘皮苷溶液（0.15%、0.30%和0.50%橙皮苷PBS溶液）的滤纸圆片风干，放到每个涂有菌液的平板上，在每个培养皿中放4个纸片。每个浓度重复3个培养皿。细菌在37 ℃下培养48 h，测定抑菌圈直径大小，确定抑菌效果。

2结果与分析

2.1橙皮苷提取的单因素试验

2.1.1料液比对橙皮苷提取率的影响。取0.5 g橙皮粉，在固定提取时间为30 min、pH为10、超声功率为200 W的条件下，考察料液比对橙皮苷提取的影响。从图2可以看出，当料液比为20～30 mg/mg时，橙皮苷提取率随料液比的增加而增加；当料液比>30 mg/mg时，提取率增加并不明显。因此，确定最佳的料液比为1∶30。

2.1.2乙醇浓度对橙皮苷提取率的影响。从图3可以看出，当乙醇浓度为60%时，橙皮苷提取率达到最高。这主要是由于橙皮苷含有酚羟基，极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。

2.1.3提取时间对橙皮苷提取率的影响。从图4可以看出，当浸提时间在30 min左右时，提取率较高，当浸提时间小于30 min或大于30 min时，产率都较低。其原因可能是橘皮苷分子中的酚性轻基在碱液作用下逐渐从橘皮中溶解出来，浸泡时间太短橘皮苷溶解不充分，而浸泡时间过长部分橘皮苷分解，体现橘皮苷在水中的不稳定性。

2.1.4pH对橙皮苷提取率的影响。从图5可以看出，当pH 9～12时，橙皮苷的提取率随溶液pH的增加而逐渐提高，在pH 12时橙皮苷的提取率最高。这可能是由于橙皮苷易溶于碱性溶液，碱性乙醇提取剂更有利于橙皮苷溶解，当达到橙皮苷的最适宜溶解条件时，橙皮苷的提取率明显提高。当溶液pH 12～13时，橙皮苷的提取率趋于平稳且略微下降，并且产生有刺激性气味的气体。这可能是由于在强碱性提取环境下，橙皮苷的某些化学结构发生变化，使得橙皮苷变性，提取率下降。

2.2橙皮苷提取的正交试验在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，优化提取时间、pH、料液比和乙醇浓度4个因素，确定最佳提取条件。正交试验设计如表1所示。

由表2可知，影响橘皮中橙皮苷提取率的因素依次是提取时间、乙醇浓度、溶液pH、料液比。其中，提取时间是影响橙皮苷提取率的主要因素。通过正交试验，确定橘皮中橙皮苷提取的最佳工艺条件为A2B1C2D2，即料液比为1∶40，乙

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