摘要：在室内测定了罗默碱对８种植物病原真菌和１１种动物病原细菌的抑菌活性。结果表明，罗默碱对梨锈病菌、柿角斑病菌、柑橘疮痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗凤梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌８种植物病原真菌的菌丝生长有明显的抑制作用，质量浓度为０．５ ｇ／Ｌ时，７２ ｈ（甘蔗凤梨病菌为４８ ｈ）的抑菌率分别为１００．００％、７７．４５％、７６．８８％、１００．００％、１００．００％、８５．７１％、１００．００％和５９．２１％；有效中浓度（ＥＣ５０）分别为０．０３７ ８、０．１９５ ６、０．173 2、０．０４４ １、０．２６５ ２、０．２５９ ０、０．０９９ ５和０．３４１ ０ ｇ／Ｌ。罗默碱对蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、藤黄微球菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌的抑菌圈直径为９．５０～１８．７５ ｍｍ，而对普通变形杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌没有抑制作用。罗默碱对巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌的最小抑制浓度均为０．３ ｇ／Ｌ，对蜡状芽孢杆菌的最小抑制浓度为０．７ ｇ／Ｌ，对溶壁微球菌的最小抑制浓度为０．２ ｇ／Ｌ。
关键词：罗默碱；病原菌；抑菌活性
中图分类号：Ｓ４８２．２；Ｒ９７８．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2664-04
Inhibitory Activity of Roemerine against Pathogenic Fungi and Bacteria
ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ｈｏｎｇａ，ＤＥＮＧ Ｙｅ－ｃｈｅｎｇａ，ＴＡＮＧ Ｈｕａｎｇｂ，ＬＵＯ Ｈａｉ－ｙｕａ，ＮＩＮＧ Ｌｅｉａ
（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ａｎｄ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；ｂ． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４， Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ８ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ １１ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ Ｓｙｄ，Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ Ｅｌｌ．ｅｔ Ｅｖ，Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｎｉｖｅｕｍ （Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ） Ｓｙｎ．ｅｔ Ｈａｎｓ，Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ（ｄｅ Ｓｅｙｎｅｓ） Ｖ． Ｈｏｈｎｅｌ，Ｇｌｏｒｏｓｐｒｉｕｍ ｍｕｓａｒｕｍ Ｃｏｏｋｅｅｔ Ｍａｓｓ，Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ （Ｃｅｓ．） Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｓｅｎｔｉｎａ （Ｆｒ．） Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０．５ ｇ／Ｌ against the 8 fungi ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ １００．００％，７７．４５％，７６．８８％，１００．００％，１００．００％，８５．７１％，１００．００％ ａｎｄ 5９．２１％ ａｆｔｅｒ ７２ ｈ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ （ｗｈｉｌｅ ４８ ｈ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔ． ｐａｒａｄｏｘａ）， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ ｗｅｒｅ ０．０３７ ８，０．１９５ ６，０．173 2，０．０４４ １，０．２６５ ２，０．２５９ ０，０．０９９ ５ ａｎｄ ０．３４１ ０ ｇ／Ｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｏｆ rｏｅｍｅｒｉｎｅ ｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｆｒａｎｋｌａｎｄ，Ｂ. ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｄｅ Ｂａｒｙ，Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ） Ｃｏｈｎ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ rｏｓｅｎｂａｃｈ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｃｏｈｎ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｗａｒｒｅｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓｈｉｇａ） Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ＆ Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｗas ９．５０~１８．７５ ｍｍ． Ｂｕｔ ｉｔ had no ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｈａｕｓｅｒ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｍｉｇｕｌａ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｍｉｇｕｌａ） Ｃａｓｌｅｉｌｌｉｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ． Ｔｏ Ｂ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓ． ａｕｒｅｕｓ，Ｍ ｌｕｔｅｕｓ，Ｓ． ｔｙｐｈｉ ａｎｄ Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，ｔｈｅ ＭＩＣ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ ｗas ａｌｌ ０．３ ｇ／Ｌ． Ｔｏ Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ ａｎｄ Ｍ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ， that was ０．７ ｇ／Ｌ ａｎｄ ０．２ ｇ／Ｌ respectively．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ； ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ
罗默碱（Ｒｏｅｍｅｒｉｎｅ）又叫斑点亚洲罂粟碱、莲碱、绕袂碱［１，２］，是阿朴菲类异喹啉生物碱。主要存在于荷叶、地不容（广西地不容、云南地不容等）、凹叶厚朴和黄藤等植物中［３－７］。研究发现罗默碱能明显舒张ＮＥ预收缩的大鼠胸主动脉，是舒张血管的天然活性物质［８］，并能明显抑制Ｈ－哌唑嗪与－受体结合，是受体的拮抗剂［９，１０］。瞿庆喜等［６］研究发现罗默碱具有α－葡萄糖苷酶抑制活性。邓业成等［１１，１２］报道了广西地不容中Ｌ－罗默碱对水稻褐飞虱的杀虫活性及对４种农作物病原菌的抑菌活性，说明其在农药领域也有很好的应用前景。本研究进一步测定了罗默碱对８种植物病原真菌和１１种动物病原细菌的抑菌活性，旨在为罗默碱的开发利用提供依据。
１材料和方法
１．１材料
１．１．１供试药品供试药品罗默碱由广西师范大学药用资源与分子药物化学教育部重点实验室合成，包含Ｌ型和Ｄ型两种构型。
１．１．２供试植物病原真菌８种供试植物病原真菌为：梨锈病菌（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ Ｓｙｄ）、柿角斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ Ｅｌｌ．ｅｔ Ｅｖ）、柑橘疮痂病菌（Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ ｆａｗｃｅｔｔｉｉ Ｊｅｎｋｉｎｓ）、西瓜枯萎病菌［Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｎｉｖｅｕｍ （Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ） Ｓｙｎ．ｅｔ Ｈａｎｓ］、甘蔗凤梨病菌［Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ （ｄｅ Ｓｅｙｎｅｓ） Ｖ． Ｈｏｈｎｅｌ］、香蕉炭疽病菌（Ｇｌｏｒｏｓｐｒｉｕｍ ｍｕｓａｒｕｍ Ｃｏｏｋｅｅｔ Ｍａｓｓ）、玉米炭疽病菌［Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ （Ｃｅｓ．） Ｗｉｌｓｏｎ］、梨褐斑病菌［Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｓｅｎｔｉｎａ （Ｆｒ．） Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ］。
上述８种植物病原真菌通过从田间采集植物发病部位，在室内用ＰＤＡ培养基分离纯化获得。
１．１．３供试动物病原细菌供试动物病原细菌为：蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｆｒａｎｋｌａｎｄ）、巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｄｅ Ｂａｒｙ）、枯草芽孢杆菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ） Ｃｏｈｎ］、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｒｏｓｅｎｂａｃｈ）、溶壁微球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ Ｆｌｅｍｉｎｇ）、藤黄微球菌［Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）Ｃｏｈｎ］、伤寒沙门氏菌［Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）Ｗａｒｒｅｎ ＆ Ｓｃｏｔｔ］、痢疾志贺氏菌［Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ （Ｓｈｉｇａ） Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ＆ Ｃｈａｌｍｅｒｓ］、普通变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｈａｕｓｅｒ）、铜绿假单孢菌［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ） Ｍｉｇｕｌａ］、大肠杆菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｍｉｇｕｌａ） Ｃａｓｌｅｉｌｌｉｉ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ］。
上述１１种动物病原细菌由桂林医学院微生物实验室提供。
１．２方法
１．２．１对病原真菌菌丝生长的抑制活性测定参考陈年春［１３］的菌丝生长速率法进行测定。将供试菌接种在ＰＤＡ平板培养基上扩大培养，备用。用丙酮、无菌水体积比１∶１作为溶媒配制药液，备用。在洁净工作台上，吸取１ ｍＬ药液（对照组用相应的溶媒代替）与热熔的９ ｍＬ ＰＤＡ培养基混匀，倒入直径９ ｃｍ的玻璃培养皿中，制成厚薄均匀的含药培养基。用直径为０．４ ｃｍ的打孔器在已扩大培养的供试菌落边缘切取菌饼，将菌饼接入带药培养基上，使有菌丝的一面朝下，每皿接３个菌饼，呈品字形分布，每个处理设３个重复。置（２７±１）℃的恒温培养箱中培养。用十字交叉法测量培养７２ ｈ（甘蔗凤梨病菌培养４８ ｈ）后的菌落直径，根据下式求出抑制率：
抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径×１００％
测定有效中浓度时，用丙酮和水组成的混合溶剂配制５个以上系列浓度的药液，测定各个浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、有效中浓度ＥＣ５０等。
１．２．２对细菌的抑制活性测定参考薛泉宏等［１４］的滤纸片扩散法进行测定。将滤纸剪成直径６ ｍｍ的圆片，灭菌，备用。在洁净工作台上，取一环已活化的供试细菌菌苔，加到１００ ｍＬ无菌水中，振荡均匀，制成浓度适宜的菌悬液（浓度１０６～１０７ＣＦＵ／ｍＬ）。吸取０．１ ｍＬ菌悬液，加到直径 ９ ｃｍ平皿的ＬＢ平板培养基上，涂布均匀，制成带菌平板。将滤纸片浸入一定浓度的药液中（滤纸片带药量约５ μＬ），然后取出晾干，贴于带菌平板上，每皿４片，中央设空白对照（空白对照滤纸片浸入相应的溶媒中），每个处理设６次重复。３７ ℃下培养２４ ｈ后，测量抑菌圈直径，并计算其平均直径。
１．２．３对细菌的最低抑制浓度（ＭＩＣ）测定参考张均田［１５］的试管法测定ＭＩＣ。取１环已活化的供试细菌，加到２０ ｍＬ肉汤培养基中，３７ ℃条件下振荡培养１０～１２ ｈ后，吸取２ ｍＬ菌液，加１８ ｍＬ肉汤培养基，稀释成适宜浓度的菌悬液（１０６～１０７ ＣＦＵ／ｍＬ），备用。将样品以丙酮、无菌水体积比１∶１为溶媒配制成系列浓度的药液，备用。无菌条件下，取若干支灭菌带棉塞的试管，编号，往每支试管加０．９ ｍＬ菌悬液、０．１ ｍＬ药液，摇匀。取０．９ ｍＬ菌悬液，加入０．１ ｍＬ溶媒，作为阳性对照组，观察细菌能否正常生长。取０．９ ｍＬ肉汤培养基，加入０．１ ｍＬ药液，作为阴性对照，观察肉汤或药液是否被污染。每个处理设３次重复。３７ ℃恒温培养２４ ｈ后，观察各试管的浑浊度，以试管中的培养液出现浑浊为有细菌生长的标志，最后一个澄清的培养液浓度为药液对细菌的ＭＩＣ。
２结果与分析
２．１罗默碱对８种植物病原真菌的抑菌活性
在室内用生长速率法测定了罗默碱对梨锈病菌、柿角斑病菌、柑橘疮痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗凤梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌的抑菌活性，结果（表１）表明，罗默碱对８种植物病原真菌的生长均有明显的抑制作用，用０．５ ｇ／Ｌ的药液处理，７２ ｈ（甘蔗凤梨病菌为４８ ｈ）的抑菌率分别为１００．００％、７７．４５％、７６．８８％、１００．００％、１００．００％、８５．７１％、１００．００％和５９．２１％。
进一步测定了罗默碱对８种植物病原真菌的毒力，结果（表２）表明，罗默碱对梨锈病菌、柿角斑病菌、柑橘疮痂病菌、西瓜枯萎病菌、甘蔗凤梨病菌、香蕉炭疽病菌、玉米炭疽病菌和梨褐斑病菌的ＥＣ５０ 分别为０．０３７ ８、０．１９５ ６、０．１７３ ２、０．０４４ １、０．２６５ ２、０．２５９ ０、０．０９９ ５和０．３４１ ０ ｇ／Ｌ。对梨锈病菌和西瓜枯萎病菌的毒力明显高于其他６种菌，相对毒力分别为９．０２和７．７３。
２．２罗默碱对１１种动物病原细菌的抑菌活性
采用滤纸片扩散法测定了罗默碱对１１种动物病原细菌的抑菌活性，结果（表３）表明，用１．０ ｇ／Ｌ的罗默碱处理，对蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、藤黄微球菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌的抑菌圈直径为９．５０～１８．７５ ｍｍ，而对普通变形杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌３种革兰氏阴性菌没有抑制作用。
２．３罗默碱对１１种动物病原细菌的最小抑制浓度（ＭＩＣ）
采用试管稀释法，测定罗默碱对１１种病原细菌的ＭＩＣ，结果（表３）表明，罗默碱对巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、伤寒沙门氏菌和痢疾志贺氏菌的MIC均为０．３ ｇ／Ｌ，对蜡状芽孢杆菌的MIC为０．７ ｇ／Ｌ，对溶壁微球菌的MIC为０．２ ｇ／Ｌ，而对普通变形杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的MIC都大于１．０ ｇ／Ｌ。
３讨论
从本研究结果可以看出，罗默碱对８种供试植物病原真菌都有很高的抑菌活性，说明罗默碱有广谱抗真菌作用，推测可能对其他病原真菌也有活性，值得进一步研究。同时，罗默碱对１１种动物病原细菌中的６种革兰氏阳性细菌也有很高的抑菌活性，推测罗默碱可能有广谱抗革兰氏阳性细菌的作用；但只对５种供试革兰氏阴性细菌中的２种有抑制活性，说明罗默碱对革兰氏阳性细菌的活性比阴性细菌的活性范围更广，这可能是因为革兰氏阳性细菌和阴性细菌的细胞壁结构和成分不同所致。罗默碱是莲属植物和千金藤属植物的活性成分，现在亦可用化学方法合成。对其结构改型进行深入研究，有可能发现活性更高的新化合物，可为新农（兽）药的创制提供新的先导化合物。
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