摘要：[目的] 为了探明氮素代谢酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因。[方法] 以不同品种的中稻为研究对象，通过盆栽试验，探讨Cd胁迫对不同水稻品种分蘖期几种氮代谢关键酶活性和植株氮磷钾积累量的差异性。[结果] 镉胁迫能够提高分蘖期水稻体内NPK含量，分别以深两优5867、甬优5550和武运粳27的提高幅度最高。同时，镉胁迫在一定程度上促进NR、GS、GOGAT 活性的提高。就NR活性而言，镉胁迫明显促进黄华占和甬优538 NR活性的提高，对武运粳27、深两优5867、甬优5550影响不明显，但相互间的差异都没达到显著水平。而对于GS活性，以镉正常处理下GS活性较低的黄华占和武运粳27对镉胁迫最为敏感，镉胁迫促进GS活性的增加，且两处理间差异达到0.01显著水平，但对镉正常处理下GS活性较高的深两优5867和甬优5550表现出抑制作用，相互间差异不明显。镉胁迫下任一品种相互间GS差异并未达到显著水平。镉胁迫促进分蘖期水稻GOGAT活性的提高，其中以镉正常处理下GOGAT活性最低的武运粳27的增高幅度最大。[结论]镉胁迫会对水稻的生长发育不利，使其结实率下降，千粒重减少，导致水稻不同程度的减产。
关键词：水稻;镉胁迫;分蘖期;氮代谢
中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）02-019-04
Effects of Cadmium Stress on Key Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism and Nitrogen， Phosphorus and Potassium Accumulation of Different Varieties of Rice
HUANG Wei1，2，3，4， PENG Jian-wei1，2，3，4*，GONG Rong1，2，3，4 et al
（1.College of Resources and Environment， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Farmland Pollution Control and Agricultural Resources Use， Changsha， Hunan 410128; 3.Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Nutrition in Common University， Changsha， Hunan 410128; 4.National Engineering Laboratory on Soil and Fertilizer Resources Efficient Utilization， Changsha， Hunan 410128）
Abstract [Objective] The research aimed to study the effects of nitrogen metabolism enzymes on Cd tolerance of rice and the physiological reasons of Cd tolerance of rice. [Method] The pot experiment was used to explore the differences of activities of key enzymes involved in N metabolism and N，P and K accumulation under Cd stress during the tilliering stage of different varieties of rice. [Result] Cadmium stress could increase N，P，K concentration of different varieties of rice in the tillering stage， while Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550 and Wu-Yunjing 27 showed the highest amplification. Morever， cadmium stress could contribute to the increase of the activities of NR， GS and GOGAT.For the activity of NR， the cadmium stress significantly contributed to the increase of NR activity of Huang-Huazhan and Yongyou 538， but wasn’t significant for Wu-Yunjing 27，Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550.However the difference among them wasn’t obvious.For the activity of GS， Cd stress promoted GS activity. Huang-Huazhan and Wu-Yunjing 27 with low activity in Cd normal level were the most sensitive. Meanwhile， the difference between two treatments was the most significant. On the other hand，the normal treatment of Cd restrained the GS activity of Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550， and the difference wasn’t significant. And under cadmium stress， either difference reached significant in GS activity. Cd stress improved the activity of GOGAT，and Wu-Yunjing 27 showed the highest improvement which showed the lowest GOGAT activity under Cd normal level. [Conclusion]Cadmium stress had adverse effect on rice growth and development，wich made its lower seed setting rate， 1000 grain weight decreased， resulting in different reduction degrees of rice output.
Key words Rice; Cadmium stress; Tillering stage; Nitrogen metabolism
基金项目 “十二五”国家科技支撑计划项目，“南方丘陵山地农区农业面源污染防控技术集成与示范”，2012BAD15B04;湖南省高校创新平台开放基金项目，“水稻对生长关键期高温逆境的氮代谢响应机理研究”，13K061;湖南省自然科学基金项目，“水稻对生长季极端高温氮代谢的响应机理研究”，12JJ6016。
作者简介
黄维（1989-），男，湖南湘阴人，硕士研究生，研究方向：施肥原理与技术。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事植物营养生理与环境生态方面的研究。
收稿日期 2014-12-02
镉（Cadmium，Cd） 是在所有污染土壤的重金属元素中毒性最强的重金属之一。与其他元素相比，Cd的特殊性在于它不能被土壤微生物分解，只能在环境中迁移和转化，具有更强的从土壤向植物迁移的能力，在环境中活性较强。同时，Cd是一种对动植物都具有毒害作用的重金属元素，具有较高的移动性和较低的中毒浓度，对各种生物有机体具有潜在的毒性[1]。水稻是镉吸收能力较强的作物[2]。当生长于有毒重金属污染的土壤中时，过量的有毒重金属在其根、茎、叶以及籽粒中大量积累，不仅严重影响水稻的生长发育，而且严重影响稻米品质。我国65%以上的人口以稻米为主食。近年来，我国稻米遭受Cd污染非常严重，不仅危害人们的健康[3]，而且对水稻生产的地区经济打击巨大，所以有关水稻Cd污染的研究意义重大[4]。Cd在自然界中的背景值较低[5]，但是随着全国工业化的发展，“三废”的不合理排放、固体废弃物处理不善、污水灌溉、污泥农用以及施用含有重金属元素的肥料等使得我国被镉污染的稻田面积越来越多，并且有增加的趋势[6]，促使大量的Cd被释放进入农田生态系统，造成农田土壤中Cd含量激增，导致严重超标。目前我国被Cd污染的耕地约1.13 ×106 hm2，覆盖11个省市[7]，每年因重金属而减产的粮食约1 000亿t，被污染的粮食达1 200亿t，造成至少200亿元的经济损失[8]。由于水稻具有相对较高的镉耐性和较易积累镉的特性，特别是水稻植株在没有表现出镉毒害、产量没有受影响时，稻米镉积累却已超标时表现出的隐蔽性，因此如何有效地控制稻米中镉含量是人类社会可持续发展的关键[9-12]。以不同品种水稻为试验材料，通过盆栽试验，笔者考察其在镉胁迫条件下氮素代谢及其相关酶活性的变化，以探明氮素代谢酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验于湖南农业大学耘园教学试验基地进行。供试土壤为第四纪红土发育的红黄泥，有机质含量18.669 g/kg，pH 4.73，全氮含量1.561 g/kg，碱解氮含量183.247 mg/kg，全磷含量0.634 g/kg，速效磷含量20.443 mg/kg，全钾含量49 g/kg，速效钾含量88 mg/kg。供试水稻有5个品种，分别为黄华占、武运粳27、深两优5867、甬优5550和甬优538。5月27日浸种催芽后于6月12日移栽，10月7日收获。
采用盆栽试验，试验设2因素5水平，共10个处理，其中2因素为镉污染和镉正常水平，5水平为5个水稻品种。试验于2014年在湖南农业大学农业资源系教学实习基地玻璃网室内进行，采用盆栽试验，选用20 cm×30 cm瓷质培养盆钵，内装过1 cm筛的风干土6.25 kg，装土前每千克镉污染土壤中加入相当于1 mg镉的CdCl2溶液，混匀，镉正常水平的不进行加镉处理，并将N、P、K肥作底肥一次施入，N、P2O5、K2O的施用量分别为 0.15、0.10、0.15 g/kg，重复15次，共计150盆，随机区组排列。每钵插3蔸，每蔸3株，按常规方法进行管理。在分蘖盛期，采样，测定，待稻谷成熟后收割、晒干、脱粒，同时按盆收获，考种计产。
1.2 测定项目及方法
1.2.1
基础土壤。测定全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾、有机质、pH等。
1.2.2
植株全氮、磷、钾。用H2SO4-H2O2消煮，全氮用半微量凯氏定氮法测定，全磷用钒钼黄比色法测定，全钾用火焰光度法测定。
1.2.3
氮代谢关键酶活性测定。
1.2.3.1
硝酸还原酶（NR）。采用硝基水杨酸比色法。
单位鲜重样品中NR活性=X×V1/（V2×W×t）
式中，X为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg;V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml;V2为酶反应时加入的粗酶液体积，ml;W为样品鲜重， g;t为反应时间，h。
1.2.3.2
谷氨酰胺合成酶（GS）。用Sigma公司生产的γ-谷氨酰基异羟肟酸作标准曲线，测定GS活性。酶活力以每小时每克鲜样生成的γ-谷氨酰基异羟肟酸微摩尔数。
单位鲜重样品中GS活性=X×V1/（V2×W×t）
x为反应液酶催化产生的r-谷氨酰基羟肟酸的总量;其余同上。
1.2.3.3
谷氨酸合成酶（GOGAT）。参照 Singh 等[11]的方法，测定GOGAT活性。酶活力用每小时每克鲜样催化氧化的NADH微摩尔数（mol/（h·g））表示。样品在紫外分光光度计内每30 s消耗NADH的量（μg）作为一个酶活力单位。
GOGAT活性=X×V1/（V2×W×t）
式中，X为反应液酶催化30 s消耗的NADH（μg）的量;V1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml;V2为酶反应时加入的粗酶液体积，ml;W为样品鲜重，g;t为反应时间，30 s。
1.2.4
考种与计产。考查每盆穗数、粒数、千粒重、结实率。
1.3 数据分析
所有试验数据采用Microsoft Excel 2003进行整理和作图。不同处理间差异采取SPSS 10.0软件进行单因素方差分析，采取LSD法进行显著性检验（P<0.05）。所有结果数据均以平均值的形式来表达。
2 结果与分析
2.1 镉胁迫对分蘖期水稻干物质累积的影响
分蘖期是指植物从出苗至拔节以前的这一段时期，主要以生长根、叶、分蘖等营养器官为主，是植物一生中根系生长最旺盛和大量发展的时期，也是生殖器官开始生长发育的重要时期。就叶片来说，所有的近根叶在这一时期长出，出叶数占总叶片数3/4左右。所以，分析植株氮磷钾的累积量对于研究植物生长走势和生长所需元素来说至关重要。
由表1可知，镉胁迫影响分蘖期水稻对矿质元素的吸收。从整体上说，加镉处理对水稻分蘖期生长具有促进作用，表现为地上部分干物质累积量的增加。但是，其影响程度因不同基因型和元素种类而异。除黄华占和武运粳27外，镉胁迫均提高了其余3个品种地上部分的氮累积量，其中深两优5867两处理之间差异显著，其余4个品种氮素含量之间差异不显著。同时，镉胁迫减少了地上部分P的累积，但累积程度因品种而异，黄华占、武运粳27、深两优5867在镉胁迫下均表现为对P的干物质积累量减少，但以甬优5550的升高幅度最大，达33%。镉胁迫对地上部分钾累积的影响因基因类型的不同而变化，镉胁迫减少黄华占和武运粳27对K的干物质积累量，但提高其余3个品种对K的积累量。减少或提高的幅度因基因型的不同而不同，但只有武运粳27两处理间K积累量标线出显著差异。
从表1还可以看出，同一处理干物质的累积量因基因型不同而表现出差异。镉正常处理中氮素的干物质量以黄华占和武运粳27最高，分别为0.675 7、0.582 8 kg/钵，但它们之间差异不显著。甬优5550积累量最低，深两优5867与黄华占之间的差异达到0.01水平显著，但是与其余3个品种之间差异不显著。镉胁迫处理中武运粳27与黄华占、深两优5867间氮存在差异，但没有达到极显著水平。不同品种镉正常处理间P素干物质积累量以深两优5867最高，以甬优5550最低，但差异不显著，黄华占与除甬优5550之外的其余3个品种间差异达0.01显著水平。此外，在不同品种加镉处理间，甬优5550对P的积累量最高，深两优5867最低，它们之间差异在0.01水平极显著，黄华占、武运粳27、甬优538之间差异都没达到0.01显著水平。就K素含量而言，镉正常处理以甬优5550以及镉胁迫处理以深两优5867积累K的能力最强，其余品种相互间差异均没达到0.01显著水平。
2.2 镉胁迫对分蘖期水稻氮代谢关键酶活性的影响
2.2.1
镉胁迫对分蘖期水稻叶片NR活性的影响。NR是植物叶片内一种与氮代谢相关的至关重要的氧化还原酶，可催化硝酸离子还原成亚硝酸离子。
表1 Cd胁迫下不同基因型水稻分蘖期地上部植株氮、磷、钾累积量
kg/钵
注：同列不同小写字母表示P<0.05差异显著性水平，不同大写字母表示P<0.01差异极显著水平。
注：不同小写字母表示P<0.05差异显著性水平，不同大写字母表示P<0.01差异极显著水平。
图1 Cd胁迫下不同基因型水稻NR活性
由图1可知，镉胁迫影响分蘖期水稻叶片硝酸还原酶活性，其影响程度因品种而异，其中镉胁迫明显地促进黄华占和春深两优5867活性的提高;对于武运粳27、甬优5550和甬优538则为抑制作用，除甬优538外其余2个品种各处理间差异均达0.01显著水平。不同品种同一处理差异较大，镉正常处理以深两优5867和甬优5550的NR活性最高，它们之间差异不显著，但是与其他3个品种差异达0.01显著水平。镉胁迫处理也表现出相似的规律，以深两优5867和甬优5550的NR活性最高，并与其他3个品种之间存在0.05水平显著差异。由此可知，镉胁迫对分蘖期水稻NR活性的抑制作用只微弱地表现在某些NR活性较高的品种上，而对那些正常处理活性较低的品种甚至有促进作用。同一处理水稻分蘖期NR活性大小间的差异主要由基因决定。
2.2.2
镉胁迫对分蘖期水稻叶片GS活性的影响。GS是叶片内另一种对氮代谢十分重要的酶，可催化铵离子和谷氨酸来合成谷氨酰胺。在高等植物的研究中，GS也常被定义为植物氨同化所必须的酶。
注：不同小写字母表示P<0.05差异显著性水平，不同大写字母表示P<0.01差异极显著水平。
图2 Cd胁迫下不同基因型水稻GS活性
由图2可知，不同品种水稻分蘖期叶片对镉的敏感度不同。其中，以镉正常处理下GS活性较低的黄华占和甬优538对镉胁迫最为敏感，镉胁迫促进了它们GS活性的增加，且两处理间差异达0.01显著水平。但是，对镉正常处理下GS活性较高的甬优5550和深两优5867表现出抑制作用，其中甬优5550两个处理间差异达0.01显著水平。由此可知，镉胁迫对不同品种水稻的影响因基因型的不同而变化。
2.2.3
镉胁迫对分蘖期水稻叶片GOGAT活性的影响。GOGAT是以谷氨酰胺的胺基为氨供体还原α-酮戊二酸为谷氨酸的酶，是植物体产生谷氨酸的主要途径[12-13]。
由图3可知，镉胁迫促进了分蘖期水稻GOGAT活性的提高，其中以镉正常处理下GOGAT活性最低的武运粳27的增加幅度最大，其余4个品种GOGAT活性也出现小幅度的增加。
注：不同小写字母表示P<0.05差异显著性水平，不同大写字母表示P<0.01差异极显著水平。
图3 Cd胁迫下不同基因型水稻GOGAT活性
2.3 考种与计产
由表2可知，镉正常处理无论是在株高、穗长、结实率、千粒重抑或平均每钵产量上均大于加镉处理。这说明超标的镉元素对水稻的生长发育不利，使其结实率下降，千粒重减少，导致水稻一定程度的减产。
3 结论
研究表明，就整体而言，镉胁迫能够提高分蘖期水稻体内N、P、K含量，分别以深两优5867、甬优5550和武运粳27的提高幅度最高。同时，镉胁迫在一定程度上促进NR、GS、GOGAT活性的提高。就NR活性而言，镉胁迫明显促进黄华占和甬优538NR活性的提高，对武运粳27、深两优5867、甬优5550影响不明显，但相互间差异都没达到显著水平。而对
表2 镉胁迫对产量及其构成的影响
于GS活性，以镉正常处理下GS活性较低的黄华占和武运粳27对镉胁迫最为敏感。镉胁迫促进它们GS活性的增加，且两处理间差异达0.01显著水平，但对镉正常处理下GS活性较高的深两优5867和甬优5550表现出抑制作用，相互间差异不明显。镉胁迫下的任一品种GS活性间差异并未达到显著水平。镉胁迫促进分蘖期水稻GOGAT活性的提高，其中以镉正常处理下GOGAT活性最低的武运粳27的增加幅度最大。而镉胁迫会对水稻的生长发育不利，使其结实率下降，千粒重减少，导致水稻不同程度的减产。这与前人的研究结果[14-17]一致。由此可知，镉胁迫对氮素累积的促进作用与对3种酶活性的影响规律一致。这说明镉胁迫是通过影响植株体内与氮代谢相关的酶如NR、GS、GOGAT活性来影响植株氮代谢的。因此，研究镉胁迫条件下氮素代谢及其相关酶活性的变化，对探明氮素代谢酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因具有重要意义。
参考文献
[1] SUN Y H，LI Z J，GUO B，et al.Arsenic mitigates cadmium toxicity in rice seedings[J].Environmental and Experimental Botany，2008，64（3）：264-270.
[2] 王琴儿，曾英.镉毒害对水稻生理生态效应的研究进展[J].北方水稻，2007（4）：12-16.
[3] 鲁如坤.我国磷矿磷肥中Cd的含量及其对生态环境影响的评价[J].土壤学报，1992，29（2）：139-150.
[4] 陈京都.水稻镉胁迫响应差异机理和调控效应的研究[D].扬州：扬州大学，2013：1-10.
[5] AINA R，LABRA M，FUMAGALLI P，et al.Thiol-peptide level and proteomic changes in response to cadmium toxicity in Ortyza sativa L.roots[J].Environment Experiment Botany，2007，59（3）：381-392.
[6] 赵其国，周炳中，杨浩.江苏省环境质量与农业安全问题研究所[J].土壤，2002，1（1）：1-8.
[7] LIN A J，ZHANG X H，CHEN M，et al.Oxidative stress and DNA damages induced by cadmium accumulation[J].Journal of Environment Science，2007，19（5）：596-602.
[8] WANG C X，MO Z，WANG H，et al.The transportation time-dependent distribution of heavy metals in paddy crops[J].Chemosphere，2003，50（6）：717-723.
[9] DI TOPPILS，GABBRIELLI R.Response to cadmium in higher plants[J].Environ Exp Bot，1999，41：105-130.
[10] SCHUTZENDUBELA A，N IKOLOVA P，RUDOLF C，et al Cadmium and H2O2-induced oxidative stress in Populus canescents roots[J].Plant Physiol Bioehem，2002，40：577-584.
[11] 田艳芬，史锟.镉对水稻等作物的毒害作用[J].土壤肥料，2005（5）：26-28.
[12] 滕祥勇.甜菜谷氨酸合成酶（GOGAT）酶学特性及氮素对其酶活性的调控[D].哈尔滨：东北农业大学，2012：1-13.
[13] 马振勇，邵立红，刘利峰，等.玉米叶片谷氨酸合成酶（GOGAT）的纯化和特性研究[J].玉米科学，2009，17（5）：82-84.
[14] 王凯荣.镉对不同基因型水稻生长毒害影响的比较研究[J].农村生态环境，1996，12（3）：18-23.
[15] 江行玉，赵可夫.植物重金属伤害及其抗性机理[J].应用与环境生物学报，2001，7（1）：92-99.
[16] 张玉平，刘强，荣湘民，等.几个早稻品种氮代谢关键酶活性的比较研究[J].湖南农业大学学报，2006，32（2）：1-5.
[17] ZHANG G P，FUKAMI M，SEKIMOTO H.Influence of cadmium on mineral concentrations and yield components in wheat genotypes differing in Cd tolerance at seeding stage[J].Field Crops Research，2002，77：93-98.
