摘要：产甲烷菌在自然界中分布广泛，是一类重要的严格厌氧原核微生物，其参与的产甲烷作用通常发生在厌氧发酵过程的最后一步，可将无机物或有机化合物最终转化成甲烷和二氧化碳。由于产甲烷菌独特的厌氧代谢机制，使其在自然界碳素循环过程中起着重要作用，因此对于产甲烷菌的多样性以及代谢机制的研究越来越受到人们的关注。相对于传统的培养检测方法，分子生物学技术对于产甲烷菌的多样性及其群落结构的检测更为便捷、准确和科学。介绍了产甲烷古菌的系统分类学发展，系统地阐述了产甲烷菌定性和定量的分子生物学检测方法，总结了不同技术在产甲烷菌多样性研究中的最新成果，最后提出多种技术的复合应用将成为研究的热点。
关键词：产甲烷古菌；生物多样性；分子生物学技术；检测；复合应用
中图分类号： Q939.97文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0016-05
收稿日期：2014-03-07
基金项目：国家“973”计划（编号：2013CB733502）；国家自然科学基金（编号：21307058、21207065）；中国科学院环境与应用微生物重点实验室开放基金（编号：KLCAS-2013-05）；江苏省农业自主创新资金[编号：CX（13）3045]；江苏省高校自然科学研究面上项目（编号：13KJB610006）。
作者简介：张瑞（1990—），女，江苏连云港人，硕士，主要从事微生物和分子生物学的研究。E-mail：zhangrui1030@njtech.edu.cn。
通信作者：郑涛，男，教授，主要从事生物能源、生物材料方向的研究。Tel：（025）58139929；E-mail：zhengtao@njtech.edu.cn。能源和环境是制约当今世界经济可持续发展的两大关键问题，可再生生物质能源的研究显得尤为重要。沼气是最早被人们开发并获得广泛应用的一类可再生能源。沼气所产生的能量不仅能够减少化石能源的消耗，而且可以大大减少温室气体的排放，同时具有极大的经济效益，因此关于沼气的研究在世界范围内引起广泛的关注[1]。
微生物群落结构的组成决定其所具有的生态功能，对参与某一特定生物化学转化作用的微生物菌群的定性和定量研究对于探讨其参与反应的机理及关键步骤的解析具有重要的意义。沼气的产生是由多种微生物菌群协同参与的复杂转化过程，参与菌群可大致分为3类：水解和发酵细菌、专性产氢产乙酸菌和产甲烷古菌[2]。产甲烷菌作为厌氧发酵过程最后一步的关键菌群，其群落的组成和数量的变化将直接影响沼气发酵速率和最终的产气量。
产甲烷古菌大多以甲酸、甲基化合物、乙酸、H2/CO2为底物原料。近年来，随着Hungate厌氧操作技术的发展，人们对于产甲烷菌的研究越来越多。产甲烷菌存在于各种极端厌氧环境中，且在不同的生态环境下，产甲烷菌的群落组成也存在差异，其代谢过程也随着环境的不同而体现出多样性[3]。自然界中甲烷主要由3 种途径产生：乙酸发酵途径、氢营养型途径 （亦称CO2还原途径） 和甲基营养型途径。不同条件下，各个途径对甲烷生成的贡献率不同。近年来随着分子生物学技术的发展，如16S rRNA克隆文库技术、变性梯度凝胶电泳技术、限制性酶切片段长度多态性分析技术和稳定同位素核酸探针技术等多种分子生物学技术的应用，克服了传统培养方法所带来的的形态和生理的变化及不可培养微生物种群缺失的缺陷，使得人们对于产甲烷菌的群落组成及其代谢机制、动力学研究越来越深入。全面准确地了解参与沼气发酵的微生物种群结构，特别是产甲烷古菌的群落组成和结构变化规律，能够为沼气发酵过程的设计优化、微生物代谢调控等提供可靠的技术参数。
1产甲烷古菌的系统分类学发展
1974年，Bryant 首次提出了产甲烷菌（Methanogen）这一概念，将其与以甲烷为能量来源的嗜甲烷菌（Methanotrophs）区分开来[4]。2001年，《伯杰氏系统细菌学手册》将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中。他们广泛存在于各种厌氧环境中，如海水沉积物、湖泊沼泽及动物瘤胃、盲肠等自然生态系统环境中；也存在于废水、稻草秸秆、禽畜粪便等非自然生态环境中[5]。产甲烷菌分类形式多样，传统的分类是基于微生物的形态结构、生理生化特性等为依据进行的，鉴于产甲烷菌生长条件苛刻，生长速率一般较低，生物量也较少，培养方法特别，其所能利用的底物种类较少，且染色、形态特征也比真细菌易变和难确定，给传统分类法带来极大的挑战。迄今为止，仅有200多种产甲烷菌被分离鉴定出来，归属于3纲5目10科29个属[6]。其中5目分别为甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）[7]。随着分子生物学的发展，人们更多地利用系统发育学分类法，依据物种间小亚基核糖体核苷酸的差异性对产甲烷菌进行鉴定和分类[8]。
2分子生物学技术在产甲烷古菌多样性中的应用
产甲烷古菌群生活在极端厌氧环境中，对温度、pH值、底物浓度等因素非常敏感。Hungate厌氧操作技术的应用与发展使得产甲烷古菌的纯培养成为可能。然而传统的培养方法较为繁琐，且无法保持微生物生态环境的一致性，而分子生物技术因其在非培养条件下对微生物遗传信息进行研究，从而被认为是产甲烷菌研究的重要且有效的手段。1996年，伊利诺伊大学第一次完成了产甲烷菌Methanococcus jannaschii的基因组测序。近年来，人们越来越多地以基因组遗传信息为依据，并运用分子生物学技术来研究物种的种群多样性、群落结构组成、菌群功能及其代谢机理。这些分子生物学技术，例如变性梯度凝胶电泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段长度多态性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization，FISH）等的引入，将产甲烷古菌这一重要环境微生物的研究带入了一个新时代。
