对照组及试验Ⅲ、Ⅳ组）的水体中，每组3个重复，每个重复30尾鱼。胁迫后0、12、24、48、72 h采集鱼鳃样本，采用HE染色石蜡组织切片及分光光度法比较酸碱胁迫对鱼鳃组织结构及其中Na+-K+-ATP酶活力的影响。[结果]对照组鱼鳃的组织结构未发现有明显病变的症状，且鳃中的Na+-K+-ATP酶活力维持在一定水平；各胁迫组鱼鳃组织结构均不同程度发生病变，出现鳃丝融合，动脉血管破损，鳃小片肿胀弯曲，顶端与末端粘充血和肿胀，黏液细胞增多，上皮细胞增生、脱落，泌氯细胞肿胀，细胞质空泡化等一系列病态症状，且其症状会随着酸碱程度的加深、暴露时间的延长而加重；酸碱胁迫后各胁迫组鱼鳃中Na+-K+-ATP酶活力均出现先升高后降低的变化，其中酸胁迫的峰值出现在48 h，而碱胁迫出现在12 h。[结论]该研究结果可为奥尼罗非鱼的养殖生产提供理论依据。
关键词 酸碱胁迫；奥尼罗非鱼；鳃；组织结构；Na+-K+-ATP酶活力
中图分类号 S912文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）11-273-04
水体的酸碱度是影响鱼类生活的重要环境因素，其直接影响鱼类的渗透调节、生长和存活等生理机能。与海水相比，淡水的缓冲能力较差，因此其酸碱度波动范围范围更大。研究表明，由于水生植物白天的光合作用及夜间动植物对CO2的释放，池塘水体的pH可在6.6～10.2范围内波动[1]。近年来，我国工业快速发展而导致的酸雨已成为水体酸化的重要因素[2]。同时，河流两岸碱性粉煤灰、氧化钙等的排出使水环境碱化严重[3]。此外，由于水体中水溶性有机物含量的增加，导致养殖池塘赤潮的形成，赤潮发生时池塘的pH可达到9.0[4]。
鳃作为鱼类呼吸的主要器官，其结构的完整性直接影响到机体的气体交换、渗透压调节及其废物排泄等功能的正常运转[5]。特别是鳃丝上皮细胞中Na+-K+-ATP酶起着离子载体和通道的初动力的作用，除了稳定细胞内外渗透压平衡外，还可以为离子逆浓度梯度的跨膜主动转运提供驱动力[6-7]，由于它与膜上磷脂结合状态的变化能够影响膜的其他功能，因此，Na+-K+-ATP酶活性也是评价污染压力[8]和离子转运能力[9]的重要生物学指标之一。大量研究表明，水体酸碱度对鱼鳃组织结构及鱼类养殖生产均具有重要影响[10-12]，关于水体盐度、酸碱性、氨氮、碳源、重金属等对鱼类鱼鳃组织结构的影响有一些研究报道[13-16]，但关于不同养殖水体酸碱度对奥尼罗非鱼鱼鳃组织结构的影响及Na+-K+-ATP酶活性的变化则鲜见报道。笔者通过苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色石蜡组织切片及Na+-K+-ATP酶活性测定的方法，检测酸碱胁迫条件下奥尼罗非鱼的鱼鳃组织结构及Na+-K+-ATP酶活性的变化，旨在了解酸碱胁迫对奥尼罗非鱼鱼鳃造成损伤状况及鳃中Na+-K+-ATP酶活性的变化，为奥尼罗非鱼的养殖生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物及其饲养管理
试验幼鱼为奥尼罗非鱼，初始体质量为（6.81±0.85）g，购自虎门沙田鱼苗场。试验前暂养于室外水池中，驯化14 d，日投喂商业饲料2次（8：00和17：00）。待摄食和生长正常后，选择体质量基本一致的健康幼鱼进行试验，正式试验前停食24 h，试验期间不投喂。
使用2 moL/L盐酸溶液和2 moL/L氢氧化钠溶液调节经曝气处理过的自来水，将水体pH分别调整为4.5、6.0、7.5、9.0、10.5（分别设为试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、对照组、试验Ⅲ组及试验Ⅳ组），每组3个重复，每个重复30尾鱼。试验在80 L的水族箱中进行，充入自来水后曝气3 d后使用。试验期间水温维持在（28±1）℃，24 h连续充氧。
1.2 样品采集
分别于胁迫后12、24、48、72 h分别从各水族箱中随机取出5尾幼鱼，经过MS-222麻醉后，立即切取右侧第二鳃弓，分成若干大小约为0.3 cm3小段后，用Bouin’s试液固定，4 ℃下保存备用。将两侧鳃余下部分全部取出置于-20 ℃冷冻保存，以供测定鳃丝Na+-K+-ATP酶活力的测定。
1.3 试验方法
1.3.1 HE染色石蜡组织切片的制备及观察。将Bouin’s液固定的鳃丝样品进行梯度乙醇脱水，经水杨酸甲酯透明，分离2片半鳃，将单个半鳃进行石蜡包埋，连续切片，切片厚度6 μm，HE染色，中性树胶封片，用光学显微镜观察、拍照。
1.3.2 鱼鳃丝Na+-K+-ATP酶活力的测定。罗非鱼幼鱼鳃丝样品经生理盐水润洗后，在冰水浴中匀浆，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清液，用超微量Na+-K+-ATP酶活性测定试剂盒 （购自南京建成生物工程研究所）测定。Na+-K+-ATP酶活性的测定采用比色法，活性单位定义为1 h在含有1 mg组织蛋白的组织中ATP酶参与分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个酶活性单位（U）。
1.4 数据处理
采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA） 和Duncan’s 检验法统计分析（P<0.05） 。试验结果均以平均值±标准差（ ± SD）表示。
2 结果与分析
2.1 酸碱胁迫对奥尼罗非鱼幼鱼鳃组织结构的影响
从图1可以看出，对照组奥尼罗非鱼的鳃丝发达，排列紧密，细胞间无明显间隙；鳃丝向两侧伸出半圆形扁平囊状的鳃小片，平行排列，窄且长，均匀分布在鳃丝两侧。鳃丝上皮由多层上皮细胞组成，包括黏液细胞、泌氯细胞、和扁平细胞等。在鳃小片上皮中有扁平细胞、柱细胞即支持细胞以及血管道等，血道内存在血细胞。鳃小片上泌氯细胞的分布出现以下明显特征：主要在鳃小片的基部区域，泌氯细胞数量较少，且多相邻分布，并与鳃小片柱状毛细血管相邻，胞体和胞核均较大而明显，多为长柱形或卵圆形；同时，黏液细胞丰富，胞体较大，胞质透明，广泛分布于鳃丝上皮中；鳃小片上皮中的扁平细胞薄且呈长梭型，排列紧密，且泌氯细胞呈现相邻状态（图1A～D）。
与对照组相比，试验Ⅰ组奥尼罗非鱼的鳃丝组织结构（图1E～H），鳃丝中间的动脉血管出现明显的破损以致血管内血细胞呈现散乱分布（图1G～H）；鳃小片有显著的变形呈弯曲状态，其顶端和末端也有明显的充血和肿胀，相邻的鳃小片出现融合现象，有部分鳃小片出现脱落（图1E、H）；鳃丝上皮中的黏液细胞数量增多，上皮细胞增生，扁平细胞排列松散杂乱，出现脱落；泌氯细胞肿胀，同时出现明显的细胞质空泡化（图1F）；试验Ⅱ组也出现了血管破损、鳃小片弯曲或融合、顶端和末端也有明显的充血和肿胀、上皮细胞增生等病变现象（图1I～L），但试验Ⅱ组鱼鳃组织损伤和病变程度较试验Ⅰ组轻。
从组织切片观察表明，试验Ⅲ组（图1M～P）鳃丝的输出动脉血管出现明显的破损，血管内血细胞呈现散乱分布（图1M、P）；鳃小片有显著的变形呈弯曲状态，其顶端和末端也有明显的充血和肿胀，相邻的鳃小片出现融合现象；鳃丝上皮中的黏液细胞数量增多，上皮细胞增生，扁平细胞排列松散杂乱，出现脱落（图1N）；泌氯细胞肿胀，同时出现了明显的细胞质空泡化（图1O）；这些现象随着水体pH的增大而加重，试验Ⅳ组鱼鳃组织病理变化更加严重（图1Q～T）。
44卷11期韩春艳等 酸碱胁迫对奥尼罗非鱼幼鱼鳃组织结构及Na+-K+-ATP酶活力的影响
2.2 酸碱胁迫对奥尼罗非鱼鳃丝Na+-K+-ATP酶活性的影响
由表1可知，对同一试验组不同的胁迫时间比较发现，与胁迫前相比，除对照组外，各组幼鱼鳃中的Na+-K+-ATP酶活性均出现先升高再降低的变化趋势，其中碱胁迫组最高点均出现在胁迫后24 h，此后显著下降至72 h达到胁迫前水平；而酸胁迫组最高点则出现在48 h，其中试验Ⅱ组随后显著下降，但显著高于胁迫前水平，试验Ⅰ组则显著低于胁迫前水平。对不同处理同一胁迫时间的结果比较发现，胁迫12 h时除试验Ⅰ组外，其余各组Na+-K+-ATP酶活性显著高于对照组，其中碱胁迫（试验Ⅲ和Ⅳ组）显著高于试验Ⅱ组；胁迫24 h，鱼鳃内Na+-K+-ATP酶活性从高到低依次为试验Ⅳ组、试验Ⅲ组、试验Ⅱ组、试验Ⅰ组、对照组，其中试验Ⅰ组和对照组差异不显著，其余各组间差异显著；胁迫48 h，Na+-K+-ATP酶活性从高到低依次为试验Ⅱ组、试验Ⅰ组、试验Ⅲ、试验Ⅳ组、对照组，其中试验Ⅲ、Ⅳ组差异不显著；胁迫72 h，试验Ⅲ、Ⅳ组与对照组鱼鳃内Na+-K+-ATP酶活性显著低于试验Ⅱ组，而显著高于试验Ⅰ组。
3 讨论与结论
鳃作为鱼类和其他水生动物的呼吸器官，担负机体的气体交换、渗透调节及排泄等功能。鱼鳃组织病理的变化大多与污染物或不利环境因素有关。观察水体环境对鱼类的影响，除了生化标记物、免疫学标记物以外，近年来开始采用组织病理变化的方法进行标记物检测[17-18]。水环境条件的变化可导致鱼鳃产生损伤，主要表现为2类：一是对鱼鳃直接造成的损伤，包括鳃上皮细胞的坏死与脱落等；另外，会产生因防御反应而产生的损伤，包括鳃丝上皮细胞增生、鳃小片呼吸上皮水肿等[18]。王双耀等[19]对大菱鲆幼鱼在不同PH水体内饲养54 d后发现，pH为6.8和7.8时鳃上皮细胞未见明显变化，而在pH为6.3时鳃小片上皮细胞角质化较为严重；pH 8.3 时上皮细胞出现脱离，部分出现角质化；pH为8.8时上皮细胞角质化较为严重。该试验结果表明对照组中整个试验期间鱼鳃均未出现组织损伤和病变。在试验Ⅱ和Ⅲ组中，鱼鳃明显出现了鳃小片弯曲肿胀，粘液分泌增多，顶端与末端有充血和肿胀；鳃丝融合，上皮细胞增生；扁平细胞排列松散杂乱，出现脱落；泌氯细胞肿胀，同时出现了细胞质空泡化等一系列的病态症状，症状随暴露时间的延长而加重；在试验1和4组中，其组织病变程度发生了明显的加重，甚至出现组织坏死，同时症状随暴露时间的延长而加重。由此可见，在水体pH越低或越高和暴露时间的延长的情况下，都会造成鱼鳃组织的损伤，破坏了鳃的功能。
鳃不仅是鱼类的呼吸器官，也是调控机体渗透压和离子运输的重要器官。鳃上皮的泌氯细胞中含有大量Na+-K+-ATP酶，其是横跨质膜的一种酶类，通过消耗ATP来维持Na+、K+离子的交换，在机体离子调节中发挥着重要作用，对细胞的渗透调节、物质吸收（葡萄糖、氨基酸等）和跨细胞离子运动有重要影响[20-22]。鱼类大多偏于适应中性或弱碱性环境，pH为7.0～8.5。pH过高或过低会导致鱼类的耗氧率增加，同时对水产动物体内酶的构象、功能及其酶活性产生不良影响。如，破坏氧化磷酸化偶联，影响线粒体ATP合成与释放，减少细胞ATP的合成来源[20]。对牙鲆[23]及鮸鱼[24]鳃丝的体外研究表明，二者鳃丝内Na+-K+-ATP酶活性的最适pH为7～8，高于或低于该范围其活力则显著下降。该研究结果表明，酸碱胁迫后各胁迫组鱼鳃中Na+-K+-ATP酶活力均出现先升高后降低的变化趋势，其中酸胁迫的峰值出现在48 h，而碱胁迫出现在12 h，其在峰值时的活力是正常值的2～4倍，其主要原因可能是在酸碱胁迫的条件下鱼的耗氧量增加，需要更多的能量提供给鳃以保证机体氧的供应。
参考文献
[1] LI C C，CHEN J C.The immune response of white shrimpLitopenaeus vannameiand its susceptibility toVibrio alginolyticusunder low and high pH stress[J].Fish & shellfish immunology，2008，25：701-709.
[2] HAN G Q，WU Q X，TANG Y.Acid rain and alkalization in southwestern China：Chemical and strontium isotope evidence in rainwater from Guiyang[J].Journal of atmospheric chemistry，2011，68：139-155.
[3] ZHOU J，WANG W N，MA G Z，et al.Gene expression of ferritin in tissue of the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannameiafter exposure to pH stress[J].Aquaculture，2008，275：356-360.
[4] 王安利，王维娜.虾池赤潮与环境因子之间的关系的研究[J].海洋学报，1995，17（2）：128-133.
[5] 周海云，洪华嫦，王喜梅，等.五氯酚对鱼鳃丝组织结构及电解质元素的影响[J].应用与环境生物学报，2004，10（1）：84-87.
[6] LIN C H，TSAI R S，LEE T H.Expression and distribution of Na+-K+-ATPase in gill and kidney of the spotted green pufferfish，Tetraodon nigroviridis， in response to salinity challenge[J].Comparative biochemistry and physiology part A：Molecular & integrative physiology，2004，138（3）：287-295.
[7] YANG W K，HSEU J R，TANG C H，et al.Na+-K+-ATPase expression in gills of the euryhaline sailfin molly，Poecilialatipinna，is altered in response to salinity challenge[J].Journal of experimental marine biology and ecology，2009，375（1）：41-50.
[8] 尹飞，孙鹏，彭士明，等.低盐度胁迫对银鲳幼鱼肝脏抗氧化酶、鳃和肾脏ATP酶活力的影响[J].应用生态学报，2011，22（4）：1059-1066.
[9] MANCER J M，MCMCORMICK S D.Rapid activation of gill Na+-K+-ATPase in the eurryhaline teleostFundulus heteroclitus[J].Journal of experimental zoology，2000，287（4）：263-274.
[10] 范龙霞.水体pH值在养殖生产中的作用[J].黑龙江水产，2005（3）：22-23.
[11] 邓希海.渔业生产中pH值的作用及调节[J].北京水产，2007（6）：10-12.
[12] 孙红玲，高振宏，王淑琴，等.浅析影响宁夏地区鱼类生长的水环境因素[J].宁夏农林科技，2009（5）：59-69.
[13] 王艳，胡先成.不同盐度下鲈鱼稚鱼鳃的显微结构观察[J].海洋科学，2009，33（12）：138-142.
[14] MICHELLE Y，MONETTE D，TAKASHI Y，et al.Physiological，molecular，and cellular mechanisms of impaired seawater tolerance following exposure of Atlantic salmon，Salmo salar，smolts to acid and aluminum[J].Aquatic toxicology，2010，99：17-32.
[15] LIEW H J，SINHA A K，NAWATA C M，et al.Differential responses in ammonia excretion，sodium fluxes and gill permeability explain different sensitivities to acute high environmental ammonia in three freshwater teleosts[J]. Aquatic toxicology，2013，126：63-76.
[16] YANG W，XIANG F H，SUN H J，et al.Changes in the selected hematological parameters and gill Na/KATPase activity of juvenile crucian carpCarassius auratus during elevated ammonia exposure and the post-exposure recovery[J].Biochemical systematics and ecology，2010，38：557-562.
[17] VUORINEN P J，KEINANEN K，PEURANEN S，et al.Reproduction，blood and plasma parameters and gill histology of vendace（Coregonus albula L.） in long-term exposure to acidity and aluminum[J].Ecotoxicology and environmental safety，2003，54：255-276.
[18] 胡芹，周珍，周群芳，等.全氟辛烷磺酸（PFOS）急性暴露对斑马鱼鳃显微结构的影响[J].生态毒理学报，2009（4）：530-536.
[19] 王双耀，毛守康，苗治欧，等.pH 对大菱鲆幼鱼平均日增重及鳃显微结构的影响[J].天津农学院学报，2013，20（4）：10-12.
[20] 柳旭东，王际英，张利民，等.影响水产动物Na+-K+-ATP酶活力的水环境因素[J].水产科学，2009，28（3）：171-176.
[21] 罗海忠，李伟业，傅荣兵，等.盐度对四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼鱼生长及其鳃丝Na+-K+-ATP酶的影响[J].渔业科学进展，2015，36（2）：95-101.
[22] 张晨捷，高权新，施兆鸿，等.低盐度和不同硫酸铜浓度对银鲳鳃离子调节酶和肝抗氧化功能的影响[J].中国水产科学，2014，21（4）：711-719.
[23] 唐贤明，潘鲁青，田景波，等.牙鲆鳃丝Na+-K+-ATPase性质的研究[J].中国海洋大学学报，2004，34（6）：969-972.
[24] 柳敏海，罗海忠，陈波，等.鮸鱼鳃丝Na+-K+-ATPase性质的初步研究[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2007，6（1）：12-17.
