摘要[目的]鉴定一株来源于土壤的耐盐酵母菌并探讨其与植物的互作关系。[方法]对分离自恩施市龙洞河附近的马尾松根部土壤的一株真菌YSTEn005进行鉴定，并研究盐胁迫下其与植物的互作关系。[结果]条件生长试验表明，YSTEn005对NaCl的最高耐受水平可达10%，而对高浓度的K+不敏感。YSTEn005最适生长温度为28 ℃，在含4%盐的液体培养基中生长最快；其对pH耐受范围较宽，可在pH 4.0～9.0条件下生长。显微镜下观察YSTEn005是单细胞形态，菌体呈椭球型，并能够行类似酵母的出芽生殖。克隆其18S rDNA，序列分析表明该真菌与高耐盐酵母——汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）的亲缘关系最近，推测YSTEn005很可能是汉逊德巴利酵母的一株变异种。该菌和拟南芥幼苗共培养显示，YSTEn005的增殖可显著降低植株在盐胁迫下的存活率。[结论]试验得到一株耐盐酵母菌YSTEn005，该菌不能改善植物对盐分的耐受性能。
关键词真菌；耐盐酵母菌；汉逊德巴利酵母；土壤
中图分类号S154.3文献标识码A文章编号0517-6611（2017）21-0004-03
Identification of A Strain of Salttolerance Halophilic Yeast from Soil and Its Interaction with Plant
MAO Huifang1，2，PENG Jiedi2，YANG Qibo3，FANG Qing1，2* et al（1.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Enshi，Hubei 445000；2.College of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000； 3.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000）
Abstract[Objective] The aim was to identify a strain of salttolerance halophilic yeast from soil and study its interaction with plant.[Method] A halophilic yeast YSTEn005 was isolated from the Pinus massoniana rhizosphere soil in Enshi，and it interaction with plant was explored under salt stress.[Result] YSTEn005 could grow on the medium supplemented with up to 10% NaCl，and it appeared in sensitive to K+；the optimum growth temperature of YSTEn005 was 28 ℃，and growth rate was higher in medium with 4% NaCl than other series of degrees；YSTEn005 was tolerant to wide pH relatively，which ranged from 4.0 to 9.0.YSTEn005 was single cell pattern under microscope，and displayed budding similar to that of yeast.Cloning its 18S rDNA and analysis the sequence indicated that the YSTEn005 was evolutionally close to Debaryomyces hansenii，which is a halophilic yeast，suggesting that YSTEn005 was from this genus.When cocultured with plants，YSTEn005 growth promoted Arabidopsis seedlings dying significantly under salt stress conditions.[Conclusion] A strain of halophilic yeast YSTEn005 is obtained from soil，and the YSTEn005 growth is not helpful to plants tolerant to salt stress.
Key wordsFungi；Halophilic yeast；Debaryomyces hansenii；Soil
特殊生境（如鹽碱土壤、沼泽湿地）对真菌的类群有重要影响。长期生态适应，真菌类群很可能变化较大[2，5，8，11]。针对该地域的土壤，筛选真菌具有重要意义。恩施地处鄂西南山地，境内土壤多由灰质岩母岩风化而来[12]，植物种类繁多，其中马尾松分布较广。笔者采集湖北省恩施市龙洞河附近的马尾松根部土壤，进行土壤真菌筛选，获得了一株耐盐真菌，并研究了其与植物的互作关系。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土壤样品。菌株筛选土样取自湖北省恩施市龙洞河附近的马尾松根部5～8 cm深的土壤。
1.1.2培养基。菌株筛选采用马丁氏培养基：磷酸二氢钾 1.0 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，NaCl 0～12%，pH 6.5；條件生长试验采用马丁氏液体培养基；大肠杆菌DH5α培养采用LB培养基。
1.1.3分子克隆试剂。TE buffer，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH 8.0；PCR扩增用Taq（Promega）， T4 DNA ligase与克隆载体pMD18-T[TaKaRa（大连）公司]；ddH2O；扩增引物（江苏南京金斯瑞公司）（上游引物：GTAGTCATATGCTTGTCT；下游引物：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG）。
1.2方法
1.2.1土壤悬液制备与菌株筛选。90.0 mL无菌水悬浮土样10 g，于250 mL三角烧瓶中，150 r/min振荡摇匀，25 ℃培养24 h；按照10-6至 10-1梯度稀释培养后的土壤溶液，取样品稀释液0.1 mL涂布于马丁氏培养基中（含NaCl浓度分别为 2%、4%～12%）， 28 ℃培养2～3 d；选取在含4%～10% NaCl的马丁氏培养基上生长的菌落，划线分离单菌落，对分离单菌落再次进行耐盐性鉴定。
1.2.2耐受NaCl和KCl能力分析。将筛选出的YSTEn005菌株用无菌水悬浮，点1 μL于含不同浓度NaCl和KCl的马丁氏固体培养基上，放入生化培养箱中培养3～5 d。
1.2.3条件生长试验。初始接种量保持相同，分别在不同温度（25、28、37 ℃）、pH（4.0～9.0）及含不同浓度的NaCl （2%～11%）等条件下振荡培养（200 r/min）YSTEn005，每隔12 h取样并检测OD600。
1.2.4形态观察。取样品用生理盐水稀释，涂片后进行显微镜观察。
1.2.5基因组DNA抽提。离心收集3 mL 过夜培养的菌体，TE溶液洗涤2次后，加入200 μL TE悬浮菌体，沸水浴10 min，收集上清，异丙醇沉淀DNA，并用75%乙醇洗涤1次后，晾干后加入ddH2O溶解。
1.2.618S rDNA 克隆。以真菌基因组DNA为模板，采用真菌引物进行PCR扩增。PCR反应体系：引物（上、下游混合） 1 μL，DNA模板3 μL，Taq酶10 μL，加入6 μL无菌水定容至20 μL。PCR程序： 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环。
1.2.7序列分析。序列测定由金斯瑞公司（南京）完成；NCBI在线Blast，DNAMAN序列比对，使用MEGA 6.0 Neighbor-Joining 方法构建系统发育树。
1.2.8菌-植共培养。培养无菌拟南芥幼苗，置于涂布有YSTEn005（菌液浓度OD600=0.02）的1/4 MS培养基上，培养（22 ℃ 18 h光照、20 ℃ 6 h黑暗）3 d。
2结果与分析
2.1耐盐能力与菌体形态28 ℃培养3 d，挑取19个能够在4%～10%盐生长的单菌落进行二次筛选，其中1株（命名为YSTEn005）能够在较高盐浓度下生长。分别在含不同浓度的KCl、NaCl 培养基上进行耐性鉴定，如图1A所示，该菌可在4%～10% KCl条件下生长，并且菌斑大小无明显差异，表明YSTEn005可能对K+不敏感；YSTEn005可在10%的盐浓度下生长，但相较4% NaCl情况下，菌体生长明显变慢，表明10% NaCl浓度对YSTEn005细胞增殖抑制明显；使用油镜观察发现，该真菌是单细胞形态，菌体呈椭球体形，并且行出芽生殖（图1B）。注：A.不同KCl和NaCl条件下培养3 d；B.油镜观察YSTEn005细胞形态
YSTEn005在28 ℃下细胞增殖最快（图2A）；在4% NaCl浓度下菌体生长最快， 其次是2% NaCl （图2B），表明液体培养条件下其最适的盐浓度为4%；其对pH的耐受范围较宽，可在pH为4.0～9.0的液体培养基中生长，但是在pH 5.0的条件下细胞增殖最快（图2C）。
巴利酵母（D.hansenii）[13-16]（如HQ717147）的18S rDNA序列相似性最高；构建系统发育树，表明该耐盐菌YSTEn005来源于汉逊德巴利酵母属（图3），其很可能是汉逊德巴利酵母的一个变种。
2.4YSTEn005与植物幼苗互作关系采用平板共培养方法研究YSTEn005和植物之间的互作关系，结果表明，在不添加盐分（NaCl）的平板上，相较于对照组（-N-Y），该菌增殖降低了植物的存活率，表明YSTEn005增殖对植物生长产生影响（图4，-N-Y，-N+Y）；而在0.8% NaCl的条件下，有YSTEn005增殖的平板中幼苗存活率降低70%左右（图4，+N-Y，+N+Y）。YSTEn005增殖情况下幼苗存活率锐减，表明该菌增殖显著加剧，植物在盐胁迫下死亡。
马尾松在鄂西恩施地区分布较广，生长良好。该研究从恩施市龙洞河附近的马尾松根部土壤中分离出一株耐盐真菌YSTEn005。显微观察、18S rDNA序列分析及条件生长试验表明，YSTEn005很可能是汉逊德巴利酵母的一个变种。汉逊德巴利酵母对高盐浓度胁迫具有自然的耐受性能，其耐受机制逐渐受到重视[13-14，17]，成为研究真核微生物细胞耐盐的重要模式种。另外，汉逊德巴利酵母潜在的生物技术应用能力受到关注，如特殊糖醇的发酵生产、果品保藏、废水处理等[18-20]。
我国土壤盐碱化情况不容乐观，盐碱土壤的含盐量在0.6%～10.0%，即对植物生产造成较大危害[21-23]。该试验条件下，发现YSTEn005与拟南芥幼苗共培养，加剧了盐胁迫下幼苗的死亡。以上表明，该菌过度繁殖并未改善植物耐盐性能。可能是植物受到该菌的侵染，诱发植物凋亡。模拟土壤中该菌和植物互作关系，从而进一步研究实际条件下该菌的调节方式，将有助于揭示特殊生境中真菌对土壤生态系统的功能。
参考文献
[1] HAWKSWORTH D L.Global species numbers of fungi：Are tropical studies and molecular approaches contributing to a more robust estimate？[J].Biodiversity and conservation，2012，21（9）：2425-2433.
[2] O’BRIEN H E，PARRENT J L，JACKSON J A，et al.Fungal community analysis by largescale sequencing of environmental samples[J].Appl Env Microbiol，2005，71（9）：5544-5550.
[3] HAWKSWORTH D L.The magnitude of fungal diversity：The 1.5 million species estimate revisited[J].Mycol Res，2001，105（12）：1422-1432.
[4] HAWKSWORTH D L，ROSSMAN A Y.Where are all the undescribed fungi？[J].Phytopathology，1997，87（9）：888-891.
[5] ZEILINGER S，GUPTA V K，DAHMS T E S，et al.Friends or foes？ Emerging insights from fungal interactions with plants[J].FEMS microbiology reviews，2016，40（2）：182-207.
[6] HARDOIM P R，VAN OVERBEEK L S，BERG G，et al.The hidden world within plants：Ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes[J].Microbiology and molecular biology reviews，2015，79（3）：293-320.
[7] 梁昌聰，肖艳萍，赵之伟.云南会泽废弃铅锌矿区植物丛枝菌根和深色有隔内生真菌研究[J].应用与环境生物学报，2007，13（6）：811-817.
[8] 张晶，张惠文，李新宇，等.土壤真菌多样性及分子生态学研究进展[J].应用生态学报.2004，15（10）：1957-1962.
[9] 王芳，图力古尔.土壤真菌多样性研究进展[J].菌物研究，2014，12（3）：178-186.
[10] PUSZTAHELYI T，HOLB I J，PCSI I.Secondary metabolites in fungusplant interactions[J].Frontiers in plant science，2015，6：573.
[11] TRESEDER K K，LENNON J T.Fungal traits that drive ecosystem dynamics on land[J].Microbiology and molecular biology reviews，2015，79（2）：243-262.
[12] 李明龙，杨廷安，杨良策，等.湖北恩施州农业地质条件及工作方法探讨[J].资源环境与工程，2014，28（6）：915-918.
[13] PRISTA C，LOUREIRODIAS M C，MONTIEL V，et al.Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii[J].FEMS Yeast Res，2005，5（8）：693-701.
[14] PRISTA C，MICHN C，MIRANDA I M，et al.The halotolerant Debaryomyces hansenii， the Cinderella of nonconventional yeasts[J].Yeast，2016，33（10）：523-533.
[15] BREUER U，HARMS H.Debaryomyces hansenii-An extremophilic yeast with biotechnological potential[J].Yeast，2006，23（6）：415-437.
[16] AGGARWAL M，MONDAL A K.Role of Nterminal hydrophobic region in modulating the subcellular localization and enzyme activity of the bisphosphate nucleotidase from Debaryomyces hansenii[J].Eukaryot Cell，2006，5（2）：262-271.
[17] 付畅，杨传平，刘桂丰，等.酵母耐盐机制的研究进展[J].遗传，2003，25（6）：757-761.
[18] 张丽丽，廖德芳，丁重阳，等.汉逊德巴利酵母发酵葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇[J].工业微生物，2010，40（4）：47-52.
[19] SINGH D，SHARMA R R，SAMUEL D V K，et al.Enhancing the bioefficacy of Debaryomyces hansenii with sodium salts for reducing the blue mould rot in apples[J].Indian phytopathology，2011，62（4）：478-483.
[20] 成细瑶，杨波，刘志刚，等.利用氨基酸废水发酵生产饲料用汉逊德巴利酵母的研究[J].饲料工业，2014（S1）：102-105.
[21] 赵百锁，杨礼富，宋蕾，等.中度嗜盐菌在生物技术中的应用[J].微生物学通报，2009，34（2）：359-362.
[22] 周和平，张立新，禹锋，等.我国盐碱地改良技术综述及展望[J].现代农业科技，2007（11）：159-161，164.
[23] 王多兵，任伟，张富春，等.盐穗木根际土壤中耐盐菌B6的分离与鉴定[J].安徽农业科学，2013，41（3）：957-960，969.
