[摘要] 目的：建立基于非线性混合效应模型（nonlinear mixed effect model，NLMEM）的雪上一枝蒿凝胶剂的药物释放动力学（release kinetic，RK）分析方法，以合理评价药物释放过程和阐释释放机制。方法：以含有随机效应的非溶蚀药物体系零级动力学模型为基础模型，采用SAS软件的PROC NLMIXED，对影响药物释放的固定效应及随机效应因素逐个进行分析，建立RK最终典型模型；采用蒙特卡罗（Monte Carlo）方法，从原始数据集中随机抽取10个训练子集分别建立RK模型，计算相对应的预测均方根误差和平均相对误差，评价模型稳定性和预测精度。结果：制剂突释效应F0对RK模型有极显著影响；组方因素中carbopol 940用量对固有释放速率常数k0及浓度梯度变化常数a有极显著影响且依据用量范围呈不同变化；不同组方的k0及 a 随机效应因素影响显著；所得RK最终模型经交叉验证稳定、有效、可靠。结论：基于非线性混合效应模型所建立的药物释放动力学分析方法，可以较好地评价药物释放过程和阐释释放机制。
[关键词]药物释放动力学；非线性混合效应模型；雪上一枝蒿凝胶剂
药物释放动力学研究的数据分析，实际上涉及一类纵向数据的分析。所谓纵向数据，是指对每个个体在不同时间进行重复观测而得到的由截面数据和时间序列数据融合在一起的数据。一般的线性或非线性模型只能处理截面数据或者时间序列数据，而不能同时分析和比较它们。采用混合效应模型对纵向数据进行处理，可同时认识研究目标与固定、随机效应因素间的横向、纵向关系，因此近年来日益得到重视 [1]。混合效应模型尤其是非线性混合效应模型主要见于群体药物动力学的研究[2-4]。
雪上一枝蒿凝胶剂的不同组方（固定效应），其不同时间释放分数的差异极为显著（P<0.01）[5]，同时似存在未知随机效应因素的影响。建立全部样本各自的释放模型，再对模型参数进行统计分析的经典方法计算量大、费时多，特别是因影响复杂难以建立固定效应的适宜模型，难以区分随机效应因素与试验误差。本研究探索用非线性混合效应模型（NLMEM）法建立雪上一枝蒿凝胶剂不同组方的释放动力学（RK）模型，希望能较好解决上述问题，为药物释放过程的科学评价、相关机制的合理阐释提供一种新的分析方法。
1基于NLMEM的药物RK分析基本思路
依据非线性混合效应模型理论，建立基于NLMEM的药物RK分析方法步骤如下。
①选择RK模型：将相同实验条件下的实验样品视为一个个体，取各个体释放数据均值（或各个体各时间点均值）对时间作图，再取全部样品各时间点释放数据的总平均，用常见RK模型进行拟合，确定适宜模型并获得模型参数初始估计值。
②影响因素分析：用观测值与数据总平均模型拟合值的标准残差对考察因素（固定效应因素）作图，分析各固定效应因素对模型参数的影响，初步判断其影响显著性及函数关系。
③构造基础模型：选择适宜统计学模型，将参数个体间随机效应因素加入已选定的RK模型中，得基础模型。
④正向筛选，建立全量模型：将固定效应因素以适宜函数形式逐个加入基础模型，每加入一项，考察Δ-2LL值，若>3.84（df=1，α=0.05），则认为该因素具有显著影响，在模型中保留该因素，否则，在模型中除去该因素，如此重复，得RK全量模型。
⑤逆向筛选，确定最终模型：在全量模型基础上，逐一减去固定效应因素或随机效应因素，每减去一项，考察Δ-2LL值，若> 7.88（df=1，α=0.005），则认为该因素具有显著影响，在模型中保留该因素，否则，在模型中除去该因素，如此重复，得RK最终模型。
⑥模型验证：采用内部验证或外部验证方法，进行模型有效性，包括拟合能力、稳定性及预测能力的验证。
⑦模型分析：结合专业知识、实验结果等，对所得模型及其参数进行深入分析。
2材料与方法
2.1材料 AE-240 电子天平，xTA-7000电热恒温干燥箱，HJ-6多头磁力加热搅拌器。雪上一枝蒿浸膏粉（自制）。Carbopol 940；甘油、三乙醇胺、溴甲酚绿、氢氧化钠、氯仿等均为分析纯。
2.2数据来源 本研究数据来自作者的一项真实试验研究[5]，其试验目的是比较雪上一枝蒿凝胶剂不同组方的释放过程差异，为其组方优选提供依据。为清楚起见，相关实验数据摘要如下。
凝胶剂组方设计及制备：用相对水平的正交设计法设计雪上一枝蒿凝胶剂的 9 种不同组方（9个不同个体），见表1。
按表称取carbopol 940，加甘油研磨20 min使部分溶胀，加适量蒸馏水研磨使充分溶胀至成为半透明状凝胶，再将处方量中和剂溶于少量水中缓慢滴加到上述凝胶中，边滴加边研匀，取处方量药物用水溶解后，缓慢加入到凝胶中，研匀，补足水至全量，研匀，密闭保存，备用。
含量测定：雪上一枝蒿凝胶剂中总生物碱的含量测定，采用离子对萃取光度法，总生物碱含量以雪上一枝蒿甲素计。方法学考察表明，雪上一枝蒿甲素回归方程为Y=-0.003 6+3.951 85X，r=0.999 8；测定最大吸收波长（416 nm）处，空白基质不干扰药物的含量测定；平均加样回收率100.9%，RSD 2.6%。方法精密度RSD 2.8%；样品供试液至少在3 h内稳定，RSD 0.97%。
累积释药分数测定：醋酸纤维膜（孔径0.22 μm）固定于释放池和接收池之间，取凝胶剂2 g置释放池中，接收池（盛有30 mL生理盐水）置（32±0.5） ℃恒温水浴中，接受液底部置一磁力搅拌转子，搅拌速度100 r·min-1，分别于0.5，1，2，3，6，12，24 h移取接受液5.0 mL，并立即补足5.0 mL生理盐水于接受池中，接受液用0.002 mol·L-1 HCl液定容至10 mL，取2.0 mL测定总生物碱含量并计算累积释药率。各组方下样品随机抽取6份进行平行测定，试样依次编号为1～54。
2.3计算软件 非溶蚀药物释放体系及其他药物RK的模型拟合由自编程序实现[6]，NLMEM 法在SAS 9.3（四川大学华西公共卫生学院卫生统计教研室计算平台）中用程序PROC NLMIXED实现。
3结果
3.1RK模型选择 凝胶剂中各组方药物释放数据见表2。取各时间点数据总平均，分别用不同RK模型拟合，结果见表3。
由于药物释放模型的研究目的除了要建立具有较好拟合效果的量-时关系以便用于释放过程的预报外，更重要的是要通过模型及其参数的比较分析，阐明影响释放的因素与制剂释放特性的结构关系。为此，笔者选择与释放过程基本特征保持一致、具有较好拟合效果、模型相对简单稳定、参数尽可能少且物理意义明确的非溶蚀药物体系零级模型[6]作为基础模型。其模型表达式为：F=k0/a×（eat-1），式中，k0 为非溶蚀型药物体系固有释放常数，与药物固有扩散性质、温度、释放面初始浓度、体系释放面面积等有关，a为浓度梯度变化常数，a<0 ， a>0 ， a=0 分别反映了浓度梯度随时间衰减、增加和恒定不变的情况。
3.2影响因素分析 用观测值与数据总平均模型拟合值的标准残差对固定效应因素作图，见图1。由标准残差是否随机集中分布在标准残差=0两侧，判断各固定因素影响是否显著和可能存在的函数形式。结果显示，carbopol 940有较为明确的影响并呈勾函数的非线性特征；甘油的影响不明显；碱类因涉及种类、用量及单、合用方式，其影响呈现比较复杂的情况。此外似应考虑突释效应F0的影响。
3.3建立基础模型 分析比较随机效应统计模型——加法、指数和比例模型的拟合情况，选择指数型随机效应模型建立雪上一枝蒿凝胶剂RK基础模型如下。
此，对非溶蚀药物体系尽量不要忽略对突释效应的分析。Carbopol 940对k 0 及a 均有极显著影响。由最终模型参数典型值，其影响方式可大致分析如下。①carbopol 940在2.0%～4.0%均有系统固有释放常数k 0>0，但在2.0%～2.65%用量增大，k0 增大；在2.65%～4.0%，用量增大，k0 减小。k 0 的大小决定凝胶剂初期的释放快慢。②carbopol 940在2.0%～4.0%，均有浓度梯度变化常数a<0，即浓度梯度均呈衰减趋势，但在2.0%～2.68%，用量增大，|a|增大，浓度梯度衰减变快；2.68%～4.0%，用量增大，|a|减小，浓度梯度衰减变缓。a的大小影响凝胶剂中后期的释放快慢。据此，适当调节carbopol 940用量，可以达到调节释放过程初期、中后期释放快慢的目的。结合组方优选时的释放期望值（F0.5 h =0.2，F6 h=0.6，F12 h=1.0）并考虑工艺简单、质量均一、释放稳定等因素，经最终典型模型（3）计算，组方2相对更好，其RMSEP和AREP分别为0.059 27，0.104 08。与文献[5]报道结果一致。
随机效应η1和η2对k 0，a具有极显著影响。初步分析表明，随机效应η1和η2主要可能与实验过程中未能严格控制的因素如加入中和剂、药物溶液和蒸馏水后的研磨速度、时间等有关，提示应对这些因素进一步严格控制，以保证制剂的质量均一。表2中一些释放分数超过1（100%），释放过程中段数据分散性较大，在一定程度上均与随机效应η1和η2的影响有关。
为保证模型的可靠性、有效性特别是模型对外部样本的真正预测能力，必须对模型进行较为严格的内部验证和外部验证[7]。本文的模型验证结果表明，采用所建立的RK研究分析方法，得到的雪上一枝蒿凝胶剂RK模型是有效的。
本研究对促使 carbopol 940 凝胶化的碱类，综合考虑了有机碱TEA、无机碱NaOH及其单用、合用的情况，其总用量均限制在基本能完全中和掉carbopol 940的限度。这种设计充分借鉴了前人经验，但尚不能充分反映更广泛范围内碱的种类、用量对凝胶形成和RK模型的影响。
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Study on release kinetics for gel of Aconitum brachypodum based on
nonlinear mixed effect model
LIN Ya-ping1*， ZHAO Ying2
（1.Food and Drug Administration of Guizhou Province， Guiyang 550004， China；
2.Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China）
[Abstract] Objective： To establish the analytical method for the release kinetic （RK） of Aconitum Brachypodum gel based on the nonlinear mixed effect model （NLMEM）， in order to rationally evaluate the drug release process and explain the release mechanism. Method： The zero-order kinetic model containing for non-corroded drug system with the random effect was taken as the base model. The fixed effect and random effect factors impacting the drug release were analyzed by PROC NLMIXED of SAS to establish the final typical model. Subsequently， 10 training subsets were randomly extracted from the primary data to respectively their RK models， calculate the corresponding predicted root-mean-square error and average relative error， and evaluate the model stability and prediction accuracy. Result： The burst effect F0 had a very significant effect on the RK model. Among the component factors， carbopol 940 showed an obvious effect on the inherence release speed constant k0 and the concentration gradient change constant a， with different variations on the basis of dosage range. The random effect factors of k0 and a had a significant impact. The final RK model was proved to be stable， effective and reliable in the cross validation.Conclusion： The drug release kinetic analysis method could be used to rationally evaluate the drug release process and explain the release mechanisms.
[Key words] drug release kinetics； nonlinear mixed effect model； Aconitum brachypodum gel
doi：10.4268/cjcmm20141411
[责任编辑 马超一]
