摘要：针对蓝藻分泌的微囊藻毒素引起的水污染问题，从太湖激浪鱼内脏中筛选出1株能够降解藻毒素的菌株，命名为JZ-4。采用实验室分离纯化的藻毒素作为惟一碳源、氮源，考察了菌株降解MC-LR的特性及其动力学模型；并通过生理生化、16S rDNA基因序列分析及其系统发育树分析对菌种进行鉴定。降解试验表明，菌株JZ-4能够在分离提纯的藻毒素混合液中生长，并且具有较强的降解藻毒素的能力，7 d内能把初始浓度为13.98 μg/L的MC-LR降解到1.43 μg/L，降解率为89.77%；菌株JZ-4对MC-LR降解符合一级反应动力学模型，其方程式为Se=S0exp（-0.301 6t）。经16S rDNA基因序列及其系统发育分析表明，该菌与杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）的相似性最高，达98%。
关键词：微囊藻毒素；筛选；鉴定；降解；杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）
中图分类号：X703；S182 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）16-3042-06
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.012
Isolation and Identification of Microcystin-degrading Bacteria from Internal Organs of the Surf Fish Living in Taihu Lake and Its Features
DONG Xiao-na1，YANG Jie2，CHEN Ze-hui1，SHEN Hong-chi1，WANG Yi-chao1，MAO Lin-qiang1，ZHANG Wen-yi1
（College of Environmental & Safety Engineering，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China；
2.The People"s Hospital of Yifeng County of Jiangxi Province，Yifeng 336300，Jiangxi，China）
Abstract： For the problem of water pollution caused by algal toxins，a bacterial strain was identified and isolated，named JZ-4 capable of degrading microcystins from internal organs of the surf fish living in Taihu Lake. The characteristic of strain JZ-4 and kinetics model of degradation of microcystin-LR，as the sole carbon source，nitrogen source were studied. The strain JZ-4 was identifiedthrough the physiological and biochemical，16S rDNA gene sequence analysis and phylogenetic tree analysis. The experiments showed that the strain JZ-4 could grow in the mixed medium. JZ-4 strain degrades the microcystin-LR from 13.98 mg/L to 1.43 mg/L. The degradation rate was 89.77%. Degradation dynamics equation of strains JZ-4 could show as Se=S0exp（-0.301 6t）. Through 16S rDNA gene sequence and phylogenetic tree analysis showed that it had a 98% similarity to Aeromonas salmonicida.
Key words： microcystins； screening； identification； degradation； Aeromonas salmonicida
近年來，有毒蓝藻已经引起全球范围内的关注，河流湖泊蓝藻暴发事件频见报到，尤其是2007年5月太湖蓝藻污染事件的社会影响最为突出。蓝藻的大量暴发，严重影响水体的生态环境。一方面蓝藻生长会与水生物争夺溶解氧，严重制约其生长；另一方面部分蓝藻在生长过程中及其死亡后会向水体中释放出有害的微囊藻毒素（简称MCs）。MCs是一类具有生物活性的环状七肽化合物，目前已发现80多种异构体[1]，其中MC-LR毒性最强[2]，也是水体中存在最普遍、含量最多、分布最广泛的MCs，占MCs总量的90%[3，4]。MCs是肽毒素，其靶器官是肝脏[5]，易诱发肝癌[6，7]。MCs是稳固的环状结构[8]，传统的水处理方法很难将其除去[8，9]，目前已从物理降解、化学降解、生物降解三大方向进行降解试验。微生物降解MCs与物理、化学等方法相比，具有成本低、安全性强、无二次污染和利于生态修复等优点[10]。利用微生物降解水体中MCs污染是安全且实用的方法。
MCs降解菌株的来源多为蓝藻暴发地区的水体、底泥及其处理含藻水体的活性污泥，刘凯英等[11]从上海淀山湖水体中筛选出1株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）；吴涓等[12]、钟升等[13]从巢湖水体中分离出1株吉氏库特菌（Kurthia gibsonii）；谷青等[14]从太湖腐烂蓝藻中筛选出1株缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）；王光云等[15]从巢湖底泥中筛选出1株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；吴林豪[16]从活性污泥中筛选出了2株气单胞菌（Aeromonas sp.）。
MCs的靶器官是肝脏，推测长期生活在水中鱼的内脏可能存在具有降解MCs的菌种。因此，本研究拟从太湖激浪鱼内脏中筛选出具有降解MC-LR能力的菌株，并考察其降解特性及其生长特性，进行降解动力学分析，提取DNA，并通过16S rDNA基因序列构建系统发育树对菌种进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 鱼内脏，取自太湖激浪鱼体内脏（鱼鳃、鱼胃、鱼肠等），研磨后，4 ℃保存。藻毒素，从晒干的蓝藻中粗提的藻毒素溶液，浓度为27.96 μg/L。
1.1.2 主要仪器与试剂 试剂均为中国产分析纯。仪器：细菌基因组DNA提取试剂盒（Ezup柱式）[生工生物工程（上海）股份有限公司]；T vector重组菌落PCR鉴定试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；酶联免疫试剂盒（上海盈公生物科技有限公司）；酶标仪（Thermo Multiskan Mk3）、高压蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS）（上海申安医疗器械厂）；倒置显微镜（olympus_BX43）、752N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；凝胶成像系统（SC810）（上海山富科學仪器有限公司）；稳压稳流电泳仪（EPS300）（上海天能科技有限公司）、紫外透射台（CUV 40A）（上海天能科技有限公司）；离心机（TGL-16C）（上海安亭科学仪器）、DNA扩增仪（TGL-16C）（美国应用生物系统公司）、超声波细胞粉碎机（JY96-Ⅱ）（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。
1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，加去离子水至1 000 mL，充分溶解，用1 mol/L的NaOH和HCl调节溶液pH至7.0，121 ℃灭菌20 min，牛肉膏蛋白胨固体培养基则在此基础上加1%～2%的琼脂粉。
M9培养基：Na2PO4·7H2O 12 g，KH2PO4 3 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，加去离子水到1 000 mL，充分溶解，用1 mol/L的NaOH和HCl调节溶液pH到7.0，121 ℃灭菌20 min。
1.2 藻毒素的提取纯化及检测
1.2.1 MCs的提取纯化 从太湖干蓝藻中提取微囊藻毒素，提取比例为1 g藻粉：50 mL 60%甲醇溶液。具体步骤[17-20]：①搅拌。对混合溶液进行磁力搅拌2 h（1 600 r/min），使其充分溶解；②细胞破碎。对混合溶液进行超声波细胞破碎60 min，静置20 min，取上清液；③离心。10 000 r/min离心15 min；④调pH去除蛋白。收集离心后取上清液，用稀硫酸调节pH为4，静置12 h；⑤过滤。通过0.45 μm滤膜过滤；⑥调pH至中性。收集滤液，用稀氨水（5%）调节pH至7左右；⑦旋转蒸发去甲醇。滤液60 ℃旋转蒸发；⑧灭菌保存。对收集的液体进行高温消毒灭菌20 min（1×105 Pa）；⑨固相萃取。稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用甲醇洗脱；⑩氮气吹干。利用氮气吹干仪吹干洗脱液中的残留杂质；11 保存。用甲醇相或水相重新溶解，-20 ℃保存作为MCs储备液。
1.2.2 MCs的测定方法 MCs异构体较多，国家《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）中规定MC-LR的限值为1.0 μg/L。因此，本研究以MC-LR为考察对象。其在水中的含量测定采用ELISA分析法，检测限为0.1～2.0 μg/L。所用MC-LR检测试剂盒购自上海盈公生物科技有限公司。
1.3 藻毒素降解菌的筛选
1.3.1 菌株的筛选与纯化 ①称取3 g已研磨的鱼内脏加入到27 mL去离子水中，30 ℃恒温振荡6 h（134 r/min）；静置2 h后用移液枪（枪头灭菌）吸取1 mL上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2、10-3…10-7稀释液；后用移液枪吸取0.1 mL稀释液进行涂布，稀释涂布的培养基采用M9培养基（添加MC-LR作底物），30 ℃恒温培养3 d，挑取优势菌落进行划线纯化[14，21，22]。将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，30 ℃恒温培养3 d，4 ℃保存，每月继代1次。②将分离出来的菌株分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30 ℃恒温振荡培养（150 r/min）；3 d后，取菌液接种于20 mL添加MC-LR作底物的M9液体培养基中，接种量为3%，30 ℃恒温振荡培养（150 r/min），设置3组重复[21，22]。空白对照中加3%的去离子水。3 d后测菌液中MC-LR的含量。③经过反复的平板划线及MC-LR去除效率的检验，最终得到1株高效的MC-LR降解菌。
1.3.2 菌株的生长曲线和菌株对MC-LR的降解曲线 ①将菌液接种于装有20 mL添加MC-LR作底物的M9液体培养基的锥形瓶中，接种量为3%，30 ℃，150 r/min恒温振荡培养，每隔24 h取样，采用酶联免疫法测定MC-LR含量，考察菌株7 d的降解效果，并绘制降解曲线，同时对最高效的降解菌进行划线观察[14]；②每隔2 h测定其在600 nm下的吸光度值（OD600 nm），并据此绘制菌株的生长曲线。
1.3.3 形态观察、生理生化试验及DNA鉴定 菌株的形态学鉴定。观察菌株的形态，并对筛选的菌株进行革兰氏染色、显微镜观察及其扫描电镜观察。
菌株的生理生化特征参考文献[23，24]中的鉴定项目和鉴定方法进行试验。
16S rDNA鉴定。①DNA提取。采用上海生工的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。②16S rDNA基因通用引物。序列为正向（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′），反向（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。③PCR反应体系。2×Taq master Mix 10.0 μL，Primer1 0.4 μL，Primer2 0.4 μL，DNA模板0.4 μL，ddH2O 8.8 μL。④PCR反应条件。95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，变性到延伸循环30次，72 ℃最终延伸10 min，结束后以4 ℃保存。⑤将PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，考察PCR扩增出的产物（16S rDNA），并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。⑥16S rDNA序列分析及系统发育分析。将所测序列与GenBank中已发表的序列进行比对（BLAST），对比菌株的相似性，初步确定菌株的属，在GenBank上查找其分类属的模式菌种并下载16S rDNA基因序列，把下载的序列及其所需对比的序列加载到Clustal X/Clustal W软件进行分析，形成多重序列匹配排列阵（Multiple alignment）。通过MAGE5.1软件，采用 N-J法对多重序列匹配排列阵进行分析，构建出系统发育树并确定菌种类别[14，25]。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态及生理生化特性
将挑选出来的优势菌株分离纯化，并进行革兰氏染色、显微镜观察及扫描电镜观察。经形态观察，菌株培养2 d后，菌株JZ-4的菌落形状为圆形，直径1～2 mm，粉白色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速。扫描电镜观察显示，菌株呈杆状。革兰氏染色结果表明其为阴性菌。
由于不同的菌株具有不同的代谢类型，因此可以根据其代谢类型初步对其进行分类。从菌株代谢途径方面对菌株JZ-4进行常规的生理生化试验（表1），从生理生化试验结果推测出菌株JZ-4属于气单胞菌属（Aeromonas）。
2.2 藻毒素降解菌的降解曲线
为研究菌株JZ-4的降解效果，将菌株JZ-4接种于装有20 mL M9液体培养基和20 mL MC-LR提取液的锥形瓶中培养（MC-LR初始浓度为13.98 μg/L），考察7 d的降解效果，并绘制曲线见图1。由图1可知，菌株JZ-4降解MC-LR的效果明显，7 d后，混合液中MC-LR浓度仅为1.43 μg/L，降解率达89.77%；其中菌株JZ-4在第3天的日降解率最高，达25.47%。
同时，为考察菌株的生长情况并研究其不同生长时期降解MC-LR的能力，试验每2 h测混合液中的吸光度值（OD600 nm），菌株JZ-4生长曲线见图2。由图2可知，菌株JZ-4在0～8 h处于生长迟缓期，在8 h时进入对数生长期，40 h时菌体浓度达到最高，随后进入生长稳定期，60 h左右进入衰亡期。菌株JZ-4的生长周期持续较长，对数期持续了近30 h，稳定期持续近20 h。对比降解曲线及其菌株生长曲线，发现菌株JZ-4在对数生长期时细胞的代谢能力最强，生长最为旺盛，此时藻毒素被迅速降解，在稳定期末菌株的数量稳定，此时降解能力最强，降解率最大；而后，随着藻毒素被降解，混合液中的碳源、氮源逐渐被消耗完，此时菌株死亡率逐渐增加，菌体数量逐渐减少，此时菌株的降解率也随之减少，在第7天的日降解率较低，仅为4.17%。因此要提高藻毒素的降解率，可调整菌株可以接种对数增长期的菌株，或者改变外界条件使其有较长的稳定期。
2.3 菌株JZ-4降解的动力学分析
以MC-LR为惟一碳源、氮源，菌株降解MC-LR，仅与MC-LR浓度有关。菌株JZ-4在降解MC-LR的过程中，MC-LR浓度在不断减少，该反应符合一级反应动力学，其方程式如下：
-■=kpS0 （1）
式中，kp为一级反应动力学常数；Se为MC-LR的浓度（μg/L）；t为时间（d）；S0为t=0时刻的MC-LR浓度（即初始浓度，μg/L）。
考察了初始浓度为13.98 μg/L，pH=7.0，接菌量为3%，温度为20 ℃时的动力学模型。根据方程（1）可整理出方程（2），即是菌株JZ-4降解MC-LR的动力学方程，公式（3）选取7 d时菌株降解数据拟合的方程。
ln■=kp■dt （2）
选取7 d时菌株降解数据拟合方程，拟合的动力学曲线见图3，其一阶函数拟合的方程为：
ln■=-0.301 6 t；R2=0.979，n=7，P=0.001 05 （3）
式中，R2為决定系数，无量纲，其值越接近1，表明拟合结果越好；n为样本数；P为显著性水平，无量纲，当P≤0.01，表明相关性显著。
决定系数R2≥0.97，说明拟合的函数能够真实反映菌株JZ-4降解MC-LR过程中ln（Se/S0）与降解时间t的规律。
方程（2）可以进一步推论出MC-LR随时间的降解历程，方程为（4）：
Se=S0exp（-kpt） （4）
带入参数可得方程（5）：
Se=S0exp（-0.301 6t） （5）
即式（5）能够很好地表征菌株JZ-4降解MC-LR的规律（图3）。
2.4 16S rDNA序列同源性和系统发育分析
DNA提取及PCR扩增的凝胶电泳结果见图4、图5。由图4可知，图中右侧有一条较为清晰的条带且对应条带下面没有其他杂乱条带；对比图中左侧的DNA Marker可知，菌株JZ-4的DNA提取片段长度在15 000～16 000 bp。由此表明菌株JZ-4的DNA提取质量较高，DNA提取成功。由图5可知，菌株JZ-4的PCR扩增成功，经16S rDNA基因通用引物扩增的序列长度在1 450～1 500 bp之间。经上海生工生物工程有限公司测序显示菌株JZ-4的16S rDNA基因序列长度为1 460 bp。
通过与GenBank数据库中的序列比对（BLAST），显示菌株JZ-4与气单胞菌属（Aeromonas）同源性最高（>99%），由此可以初步判定，其属于气单胞菌属。选取GenBank数据库中27株气单胞菌，选取一株不同菌属的菌弧菌属（Vibrio sp.）、一个不同科的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）为外围菌种，用MAGE5.1软件以邻近法（N-J）构建系统发育树[14，25]，见图6。由图6可以看出，加入了2株参比菌株后，有以下2个结果：①菌株JZ-4与气单胞菌的相似性显而易见，弧菌属（Vibrio sp.）与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）被排除在外，相关性为0，与气单胞菌的相关性为100%，因此可以推断出菌株JZ-4为气单胞菌；②JZ-4与气单胞菌在GenBank上已发现的27个模式菌株进行比较，结果显示菌株JZ-4与杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）相似性最高（达98%）。按照国际分类委员会的建议，DNA同源性70%作为定种的界限，即大于或等于70%为同一个种群，小于70%为不同种群[25]。综上所述，可基本推断菌株JZ-4属于杀鲑气单胞菌种，在系统发育地位上属于细菌（Bacteria）中变形菌门（Proteobacteria）、γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）气单胞菌目（Aeromonadales）气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属。这与菌株JZ-4的形态学特征及其生理生化特征相佐证。
国内外有报道显示气单胞菌可以降解藻毒素，吴林豪[16]首次从活性污泥中分离筛选出了两株高效的藻毒素W2（豚鼠气单胞菌（A.caviae））、W4（圣雷利气单胞菌（A.sanarellii）），其都为杆菌，革兰阴性菌，与本研究筛选的JZ-4（杀鲑气单胞菌）性质一致。但杀鲑气单胞菌能够降解MCs，在国内未见报道，为MCs降解提供了一个新型菌种。同时，本研究也证实了从太湖激浪鱼内脏中筛选藻毒素降解菌是可行的，为MC-LR降解菌株的筛选提供了新的来源。
3 小结
1）从太湖激浪鱼内脏中筛选出1株能降解藻毒素的菌株JZ-4，7 d内将初始浓度为13.98 μg/L的MC-LR降解到1.43 μg/L，降解率为89.77%，该菌种在第3天降解的增长率最高，达25.47%。菌株JZ-4生长稳定期菌株的数量稳定，此时降解能力最强，降解率较大，进入衰亡期后，降解能力显著减小。动力学分析结果表明，菌株JZ-4降解MC-LR符合一级动力学模型，其方程可表示为Se=S0exp（-0.301 6t）。
2）经鉴定菌株JZ-4属于气单胞菌属，与杀鲑气单胞菌亲缘关系最近，相似性为98%。因此，基本上可将菌株JZ-4归类为杀鲑气单胞菌。本研究提供了一种新的降解藻毒素的菌种，为生物法处理水体微囊藻毒素提供一种新的理论和应用参考。
参考文献：
[1] 冯小刚.环境中微囊藻毒素的检测、提纯及其紫外光助催化降解的研究[D].南京：东南大学，2006.
[2] MATTHIENSEN A. Environmental and laboratory studies on the properties and fate of microcystins from the cyanobacterium Microcystis[D].UK：University of Dundee，2000.
[3] LEMES G A F，KIST L W，BOGO M R B，et al. Biodegradation of [D-Leu1] microcystin-LR by a bacterium isolated from sediment of Patos Lagoon estuary，Brazil[J].Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases，2015，21：1-8.
[4] CHEN X G，YANG X，YANG L L，et al. An effective pathway for the removal of microcystin LR via anoxic biodegradation in lake sediments[J].Water Res，2010，44（6）：1884-1892.
[5] 柳丽丽，钟儒刚，曾 毅.微囊藻毒素及其毒性研究进展[J].卫生研究，2006，35（2）：247-249.
[6] FALCONER I R. An overview of problems caused by toxic blue-green algae（cyanobacteria）in drinking and recreational water[J]. Environmental Toxicology，1999，14（1）：5-12.
[7] UENO Y，NAGATA S，TSUTSUMI T，et al. Detection of microcystins，a blue-green algal hepatotoxin，in drinking water sampled in Haine and Fusui endemic areas of primary liver cancer in China by high sensitive immunoassay[J].Carcinogenesis，1996， 17（6）：1317-1321.
[8] 韓志国，武宝轩，郑解生，等.淡水水体中的蓝藻毒素研究进展[J].暨南大学学报，2001，22（3）：129-135.
[9] DUY T N，LAM P K S. Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial（blue-green algae）toxins in water[J].Reviews of Environment Contamination Toxicology，2000，163：113-185.
[10] 潘新朋，杨力力，陈晓国.微囊藻毒素的生物降解综述[J].污染防治技术，2006，19（2）：27-30.
[11] 刘凯英，薛 罡，程起跃，等.微囊藻毒素-RR高效降解菌的分离鉴定及降解特性[J].环境科学与技术，2012，35（4）：22-26.
[12] 吴 涓，钟 升，王光云.一株降解微囊藻毒素菌种的鉴定及其活性研究[J].中国环境科学，2011，31（1）：116-122.
[13] 钟 升，吴 涓，王光云.微囊藻毒素降解菌的筛选、鉴定及其降解活性研究[J].生物学杂志，2010，27（6）：57-60，64.
[14] 谷 青，赵 琪，史全良.一株降解微囊藻毒素的缺陷短波单胞菌的分离鉴定及降解特性研究[J].环境科学学报，2017，37（1）：201-206.
[15] 王光云，吴 娟，谢 维，等.微囊藻毒素降解菌的筛选、鉴定及其胞内粗酶液对藻毒素MC-LR的降解[J].微生物学报，2012， 52（1）：96-103.
[16] 吴林豪.藻毒素降解菌去除微囊藻毒素及其降解特性研究[D].上海：复旦大学，2012.
[17] 袁 媛.巢湖蓝藻藻蓝蛋白提取纯化及微囊藻毒素-LR去除研究[D].合肥：安徽大学，2014.
[18] 闫 海，潘 纲，张明明，等.微囊藻毒素的提取和提纯研究[J].环境科学学报，2004，24（2）：355-359.
[19] 张维昊，肖邦定，方 涛，等.天然水华蓝藻中微囊藻毒素的提取和净化研究[J].环境污染与防治，2003，25（5）：265-267.
[20] SPOOF L，MERILUOTO J. Rapid separation of microcystins and nodularin using a monolithic silica C18 column[J].J of Chromayography A，2002，947：237-245.
[21] LIU L，CHEN X Z，LI Q Y，et al. Isolation，identification and algicidal effect of an algicidal bacterium lysi[J].Fresenius Environmental Bulletin，2016，25（12A）：5842-5848.
[22] 李秋艳.藻毒素降解菌、溶藻细菌的分离鉴定及其原生质体制备[D].江苏常州：常州大学，2012.
[23] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].第8版.北京：科学出版社，1984.
[24] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[25] 张文艺，陈雪珍，陆丽巧，等.BAF反应器中好氧反硝化菌的分子鉴定及分析[J].土木建筑与环境工程，2012，34（1）：118-123.
