对照组、模型对照组、七花颗粒低剂量组、七花颗粒中剂量组、七花颗粒高剂量组、阳性对照组（二甲双胍），用苦味酸染色法标记。空白对照组用国家标准固体混合饲料喂养，其余各组使用高脂饲料喂养。4周后空白对照组在腹腔注射0.9%NaCl注射液，其余各组大鼠在腹腔注射30mg/kgSTZ（STZ溶于0.1mol/L、pH：4.4柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液中），之后每三天1次尾静脉采血检测血糖连续10d。空腹血糖≥11.1mmol/L且稳定时即T2DM模型复制成功，选入实验。
1.2.2 高脂饲料的配制 基础饲料67.5%（碳水化合物占53%，脂肪占5%，蛋白质占23%），食盐0.5%，白糖10%，猪油10%，蛋黄粉10%，胆固醇1%，猪胆盐0.5%，香油0.5%。实验高脂饲料由成都达硕生物科技有限公司按照上方配制，高压灭菌，真空包装，冷藏保存。
1.2.3 柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液的配制 0.1mol/L的柠檬酸母液A：2.101g-水合柠檬酸溶于100mL双蒸水中；0.1mol/L的柠檬酸三钠母液B：2.941g二水合柠檬酸三钠溶于100mL双蒸水中；二者按照A-B（28：22）的比例配制pH为4.4的缓冲液备用。
1.2.4 给药实验 共分为六组，每组8只，给药4周，灌胃给药容积为1mL/100g。实验组以七花颗粒（以临床剂量45g/60kg·d，按照体表面积换算生药剂量为：0.405g/100g·d）水煎剂，按照高中低剂量组4：2：1的梯度比例灌胃给药。阳性对照组以二甲双胍100mg/kg·d，水溶液灌胃给药。空白组和模型组不给药。测试给药第2、4周时大鼠血糖FPG。
1.2.5 脏器固定及染色 切取肝左叶、左肾及全部胰腺组织浸入10%的福尔马林溶液中固定。48h后的肝肾胰腺，通过洗涤，梯度酒精（浓度：70%、80%、90%、95%×2、100%×2，都为2h）按次序脱水，二甲苯透明，使用石蜡包埋，用轮转切片机切为薄片（厚度5μm为宜）。裱在无菌的载玻片上面，75℃烤片机烤片2h；二甲苯脱蜡5min 2次→乙醇洗蜡（100%→95%→90%→80%→70%→水冲洗）各5min。
肝脏和肾脏做HE染色（即苏木素6min+伊红3min）→70%～100%乙醇脱水→二甲苯透明→用树脂胶封片→显微镜下观察组织；胰腺做Mallory 三色法染色（Mallory 三色法染液：苯胺蓝0.5g，桔黄G 2g，磷目酸或磷钨酸1g，蒸馏水100mL）。在400倍的光学显微镜之下仔细观察肝肾和胰腺的组织病理学改变。
1.2.6 统计学方法 数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，各组数据中的计量资料用均数加减标准差（x±s）表示，行t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 基本情况 实验开始后，每一天观察每一组饮食量及饮水量并记录，每五天称量全部大鼠体重、测定FPG。
2.2.1 饮食饮水量的变化 实验开始后，大鼠T2DM模型诱导过程前期饮水量呈轻度上升趋势，饮食量略有下降。给予STZ腹腔注射后，饮食量开始下降之后上升并保持平稳，饮水量极度上升并多尿消瘦。用七花颗粒灌胃之后，实验组饮食量开始上升并保持平稳，饮水量下降；模型对照组饮食饮水量一直呈现上升的趋势。
2.2.2 大鼠体重变化 实验开始后，大鼠T2DM模型诱导过程前期体重呈上升趋势，给予STZ腹腔注射后，体重开始下降，之后用七花颗粒灌胃，体重开始上升，模型对照组体重一直呈现下降的趋势。
2.2.3 大鼠血糖变化 实验前期所有大鼠的血糖稳定正常无差异，腹腔注射STZ后，血糖到达一个峰值。给药后大鼠血糖开始下降，4周后基本呈现一种稳定的状态。选取给药后2周、4周空腹血糖，如表1所示，七花颗粒可以有效地改善糖尿病大鼠模型的空腹血糖，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.2 肝脏病理改变 由图1可知，空白对照组：肝脏被膜结构正常，未见到炎细胞浸润；肝小叶的结构完整，肝细胞索多数排列整齐，围绕着中央静脉的呈放射状排列，肝细胞无明显增生。模型对照组：模型组肝细胞普遍水肿变性，易见肝细胞呈现为点状的坏死；肝血窦扩张闭塞、扭曲；汇管区有轻度炎性细胞的浸润，部分肝细胞脂肪变性。阳性对照组：肝细胞广泛水肿变性，易出现肝细胞坏死呈点状；部分肝血窦扩张闭塞、扭曲；一些大鼠汇管区有一定的炎细胞浸润。
七花颗粒低剂量组：肝细胞普遍水肿变性，易见肝细胞坏死呈点状；肝血窦扩张闭塞、扭曲；在汇管区有一定程度的炎细胞浸润聚集。七花颗粒中剂量组：肝细胞普遍水肿变性，部分动物见肝细胞坏死呈点状；肝血窦扩张闭塞、扭曲；汇管区有轻微的炎细胞浸润。七花颗粒高剂量组：部分肝细胞轻微水肿变性，小部分出现肝细胞点状坏死；肝血窦扩张闭塞、扭曲；一些大鼠主要在汇管区有微微的炎细胞浸润。
2.3 肾脏病理改变 由图2可知，空白对照组：肾小球主要分布于肾皮质部，未见细胞增生和炎症细胞渗出，肾小球毛细血管结构清楚，未见纤维增生及变性改变；肾小管数目较多，细胞的排列整齐，小管内未见出血等病变。模型对照组：肾小球以及肾间质充血，肾小管的上皮细胞有水肿，部分肾小球增大，系膜基质增多，系膜区增宽，肾小球内可以看到粉红色的沉积物；肾小管上皮细胞水肿，肾小管里面可以看到粉红染色蛋白性渗出物，可见肾小管上皮细胞变性脱落。七花颗粒低剂量组：肾小球及肾间质充血，肾小管上皮细胞水肿，部分肾小球的体积变大，系膜基质变多，系膜区宽度增加，肾小球内有粉红沉积物；肾小管上皮细胞水肿，肾小管内可见粉红染色蛋白性渗出物，见肾小管上皮细胞变性脱落。七花颗粒中剂量组：肾小球系膜区宽度增加，有少量粉红变性沉积物，主要沿球系膜区分布；肾小管上皮细胞水肿。七花颗粒高剂量组：肾小球系膜区增宽，有少量粉红变性沉积物，病变发生于部分肾小球，小球病变成节段性，主要沿球系膜区分布；肾小管上皮细胞水肿伴随变性脱落。阳性对照组：肾小球系膜区宽度增加，部分有少量粉红变性沉积物，主要沿球系膜区分布；肾小管上皮细胞水肿。
2.4 胰腺病理改变 由图3可知，空白对照组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰；胰岛多呈现为圆形或者椭圆形的细胞团，分散在胰腺腺泡之间，数目比较多，胰岛的界限清晰，细胞团的大小各异，胰岛细胞的胞质丰富，胞浆淡染为浅粉红色，核大多数是圆形深染；胰岛内纤维成分比较少见。模型对照组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰。胰岛分布稀疏，充血水肿；可见胰岛细胞发生核缩小和凝聚、空泡水肿变性等退行性改变，胰岛细胞数目减少；有细胞核缺失，细胞体积缩小，胞浆变浅可见组织残影，有胰岛细胞坏死，胰岛内纤维细胞增生，胰岛间质有逐渐纤维化的趋势。七花颗粒低剂量组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰。胰岛分布稀疏，有充血和水肿；胰岛细胞发生核缩小和凝聚、空泡水肿变性等退行性改变，可见胰岛细胞的坏死，胰岛内的纤维细胞明显增生，胰岛间质渐渐纤维化趋势。七花颗粒中剂量组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰。可见胰岛充血水肿。偶尔出现胰岛细胞的核缩小和凝聚、空泡水肿变性等退行性改变，罕有胰岛细胞坏死，胰岛细胞数量稍稍降低；个别大鼠胰岛内纤维细胞增生。七花颗粒高剂量组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰；可见胰岛充血水肿。少见胰岛细胞发生核缩小和凝聚、空泡水肿变性等退行性改变，胰岛细胞数量略微变少；胰岛内少数纤维细胞增生。阳性对照组：胰腺外的分泌部形态清楚结构清晰；可见胰岛充血水肿；可见少量胰岛细胞发生核缩小和凝聚、空泡水肿变性等退行性改变，胰岛细胞数量有所降低；胰岛内偶见纤维细胞增生。
2.5 七花颗粒对2型糖尿病大鼠病理学改变的影响 空白对照组大鼠的肝脏、肾脏、胰腺基本正常，未见明显的病理改变。与模型组相比，七花颗粒给药组，肝脏组织细胞坏死少，脂肪变性程度轻；肾脏水肿程度低，渗出物少，粉红沉积物少；胰岛细胞数量多，核缩小和凝聚、空泡水肿变性程度轻，表明七花颗粒可以有效地改善糖尿病大鼠模型的病理组织学改变，对于糖尿病大鼠病理变化有延缓和治疗作用，对于恢复功能和阻碍病情发展效果明显。
3 讨论
由于人们的饮食结构改变，糖尿病的发病比例不断上升。糖尿病已然成为了第三大威胁人们身体健康的慢性非传染性疾病[1]。糖尿病疾病过程中所存在的高血糖，可诱发各组织，尤其是眼、心脏、血管、肾、神经的慢性损伤和功能方面的障碍。临床表现主要是多饮，多尿，多食，消瘦，疲乏无力，肥胖为主。近几年在中国糖尿病患病比例快速增长无可置疑[2]。
链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）通过葡萄糖转运蛋白2进入胰岛β细胞或烷化DNA，造成细胞死亡，使胰岛素不足引发高血糖，STZ是目前制备糖尿病动物模型使用较多的药物。本实验采用wistar雄性大鼠模拟T2DM发病过程，用高脂饲料喂养合并STZ诱导大鼠T2DM模型。先以高脂高糖饮食，诱发胰岛素抵抗，再配合低剂量的STZ，破坏部分胰岛β细胞的功能，二者相互结合使用可诱导大鼠血糖升高出现高胰岛素血症、血脂异常等病理生理的改变，与人类T2DM相类似[3]。
现代医学认为人体在代谢碳水化合物的过程中，肝脏吸收门静脉中的葡萄糖合成肝糖原，抑制糖原分解和糖异生，降低葡萄糖的浓度。血糖升高的主要原因是肝脏的胰岛素抵抗[4]。体内物质代谢重点依靠肝脏，肝脏功能的障碍自然引起代谢紊乱[5]。胰岛素分泌不足还有外周组织胰岛素抵抗是T2DM临床特点[6]。胰岛素抗性和胰岛β细胞功能受到损害是T2DM的主要病机，T2DM发病的中心环节是胰岛β细胞功能受到损害。肾小球的滤过功能受损是由高血糖引起的，从而使肾脏的超微结构的损伤病情逐步加重[7]。纤溶系统活性降低，微血管病变、糖尿病肾病等也是均是由于T2DM的胰岛素抵抗所致[8]。其是一个恶性循环的过程。肝肾脏胰腺可以反映糖尿病对机体的病理改变。检验糖尿病治疗药效方面，依靠血糖和肝肾胰腺的病理组织学改变。为糖尿病及其并发症的治疗方面提供依据，且对可临床用药有着积极的指导作用。
综上所述，七花颗粒在对糖尿病大鼠模型的症状改善，降低控制血糖方面效果显著，对肝脏、肾脏、胰腺的病理改变有一定的治疗和延缓作用。
参考文献
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[2]徐瑜，毕宇芳，王卫庆，等.中国成人糖尿病流行与控制现状-2010年中国慢病监测暨糖尿病专题调查报告解读[J].中华内分泌代谢杂志，2014，30（3）：184-185.
[3]李晓东，封德梅，赵良功，等.红芪多糖HPS-3对2型糖尿病大鼠糖脂代谢和胰腺组织病理改变的影响[J].中药药理与临床，2012，28（1）：83-85.
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[8]孔园珍，张建飞.2型糖尿病肾病与血浆tPA、PAI-1水平及HOMA-IR的关系研究[J].浙江医学，2014，（12）：1070-1072.
（编辑：陶希睿）
