[摘 要] 核苷（酸）类似物（NA）是目前临床治疗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染的首选方案，但随着治疗时间的延长，HBV耐药性的产生极易对治疗效果造成影响。HBV耐药性检测包括基因型耐药和表型耐药分析两种手段，其中前者可明确HBV基因组中已知与耐药相关的病毒变异，在近年来病毒耐药性检测领域受到了广泛关注。本文就HBV耐药原因以及DNA直接测序技术、焦磷酸测序技术等十余种基因型耐药检测方案进行综述，旨在为强化HBV耐药管理提供参考。
[关键词] 乙型肝炎病毒；耐药；检测；进展
中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2017）01-025-03
DOI：10.11876/mimt201701010
据世界卫生组织（WHO）统计，目前全球乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染者为3.5亿，其中30%患者已进展至肝硬化阶段，需及时实施长期、有效的抗病毒治疗[1]。干扰素和核苷（酸）类似物（NA）两大类抗病毒药物是目前临床治疗HBV感染的主要药物，其中，NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒复制作用明确等优势，得到了广泛应用[2]。但其缺陷在于，需长期服用方可将HBV抑制在较低水平，降低肝硬化、肝癌等继发疾病发生风险，而长期服用NA可诱导HBV耐药突变的发生，加之近年来低耐药屏障NA序贯应用的逐步推广，HBV多药耐药为临床治疗带来了更为严峻的挑战[3-4]。本文就HBV耐药机制、耐药检测及防治策略进行综述，旨在为HBV耐药的监测与分析提供参考。
1 HBV耐药原因
1.1 HBV耐药机制
缺乏校正的逆转录伴随着HBV复制的全过程，若HBV基因突变位点恰好处于HBV-DNA聚合酶的逆转录区域，则极有可能导致耐药性的产生[5]。应用抗病毒药物治疗前，慢性乙肝患者体内往往并不存在耐药株，均为野生株，但抗病毒药物对HBV的选择性作用，可逐渐导致药物敏感野生株逐渐减少、耐药株获得生存，继而成为优势病种株，最终引发HBV总体耐药性的产生[6]。
1.2 HBV耐药因素
研究表明，药物的空间结构、基因屏障及药代动力学特征均在耐药性的产生环节扮演了重要角色[7]。如拉米夫定与三磷酸脱氧胞苷（dCTP）结构差异明显，但阿德福韦酯与dCTP十分接近，故前者更易发生HBV耐药。Lee等[8]发现，拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定在发生耐药变异时，HBV耐药株仅1个位点发生突变，而恩替卡韦耐药株需在上述突变基础上发生3个位点联合突变，故初治患者恩替卡韦耐药率极低。若抗病毒药物可同时强烈抑制野生株、耐药株复制，则其药代动力学优势可保证HBV处于较低的耐药性。除抗病毒药物自身因素外，患者HBV-DNA定量、病程、年龄、依从性、治疗方案、病情等基础状态亦可对HBV耐药性造成明显影响[9]。
1.3 HBV耐药分类
HBV耐药包括基因耐药、交叉耐药两种类型，其中基因耐药即为HBV基因序列发生耐药相关基因突变，若该基因突变导致病毒株对药物敏感性降至野生株的25%以下，则被称为表型耐药；交叉耐药是指病毒在发生基因耐药的同时，不仅对某一种药物耐药，且同时对另外一种无关药物存在耐药性。目前临床常用抗病毒药物的耐药性分别为：拉米夫定20%～69%，阿德福韦酯11%～29%，恩替卡韦9%，替比福定2%～4%，随用药时间的延长，其耐药性不断增加[10]。
2 HBV耐药检测
2.1 DNA直接测序技术
DNA直接测序技术是最为经典的HBV耐药检测方法，在所有耐药变异检测技术中，DNA直接测序技术的准确性、特异性均处于较高水平，且多数学者均将该技术作为检测其他技术功效的对比标准[11]。但由于该技术耗时久、经济性差、技术落后、检出限高达20%，且易出现混合感染中少量HBV感染的漏检，近年来应用逐渐减少。
2.2 焦磷酸测序技术
焦磷酸测序在DNA直接测序技术的基础上发展而来，是借助DNA合成过程中释放的焦磷酸判断HBV耐药情况的新型酶级联二代测序技术，与过往Sanger法ddNTP参与的链终止反应相比，该技术不需电泳、荧光标记，且分析快速、灵敏度高，可实现自动化定量分析。有学者将该技术用于HBV突变质粒标准品的检测，发现该技术10 min即可完成接近100份样本的检测，且检出限低至4%[12]。但其不足之处在于阅读长度仅为40 bp，覆盖范围有限，故罗氏最新研发的454 GS FLX测序平台在该技术的基础上进一步优化，提供了超深度焦磷酸测序技术，将其阅读长度延伸至250 bp，檢出限进一步升至1%，其高灵敏度、特有基因频率分析功能得到了广泛认可，但同时也大大增加了设备成本以及数据复杂性，临床推广受限[13]。
2.3 拉链核酸检测技术
拉链核酸（ZNA）是一种寡核苷酸，可以拉链形式连接互补核苷酸，故被称为“拉链核酸”，其可被阳离子精胺衍生物单元（Z单元）修饰，进而减少核苷酸链之间负电荷排斥力、提升引物和探针退火温度，在增强双链杂交稳定性及错配识别能力方面具有重要作用[14]。由于ZNA的Tm值仅受Z单元数量、寡核苷酸链长度影响，其探针设计极为简便、灵活。有学者针对HBV YMDD、YVDD、YSDD、YIDD序列设计不同的探针，发现该技术突变病毒载量检测底线可达35 copies/mL，是其他技术检测底线的300倍以上，且其灵敏性、特异性均较高，为野生、突变株的定量比例计算提供了可能，亦可动态监测耐药株比例的实时变化[15]。其缺陷在于，需针对不同位点设计不同ZNA探针，虽然探针设计较为简便，但仍为临床工作者增加了较大的工作量负担。
2.4 AllGlo探针实时荧光PCR技术
目前TaqMan探針、分子信标、杂交探针、双链置换探针等实时PCR探针应用十分广泛，在此基础上，AllGlo探针不仅具有上述探针全部的优点，还具有更高的荧光强度、检测灵敏度、特异性及广泛的可选荧光种类，有学者将AllGlo探针同时用于四种人乳头瘤病毒的单管检测，取得了良好的效果[16]。Kitrinos等[17]设计HBV YMDD、YIDD、YVDD的针对性AllGlo探针，发现其检测限达50 copies/mL，且与直接测序法比较未发现不一致结果，显现出该技术较高的准确性。需要注意的是，AllGlo探针在保持高灵敏度的同时，对靶序列保守性的要求极高，故在突变率较高的HBV耐药性检测方面，适用性不够广泛。
2.5 量子点DNA荧光共振能量转移传感器技术
量子点DNA荧光共振能量转移（QDs-DNA-FRET）技术在单核苷酸多态性、微量DNA的检测中得到了广泛关注，其检测方法仅需3步，分别为连接量子点表面形成功能性QDs-DNA连接体、向连接体内加入报告探针、应用FRET及寡核苷酸连接酶检测反应测定荧光信号。突变型HBV存在的单碱基错配可导致QDs-DNA复合体杂交失败，故无法参与FRET反应，亦无荧光信号产生[18]。其优势在于无须PCR扩增、特异性佳，且具有高效性、快速性，可同时实施多位点检测，同时，检测设备仅需多标记分析仪，易于临床实验室推广。但该技术亦需应用大量配套特殊试剂，是限制其推广的主要原因。
2.6 PCR侵入技术
与其他PCR技术的差别在于，PCR侵入技术不是对目的核酸进行扩增，而是实施探针信号扩增，通过侵入探针、信号探针、靶核酸分子检测和侧翼核酸内切酶3个体系，该技术可迅速分开荧光基团与淬灭基团，其检测下限为10 copies/mL，耐药病毒株检测比例可低至2%，且其对信号DNA进行扩增可大大降低检测过程中造成的污染，具有较强的特异性[19]。该技术的不足之处与ZNA检测技术类似，即需根据不同位点设计对应的侵入探针、信号探针，在一定程度上增加了检测的烦琐度。
2.7 限制性片段长度多态性技术
限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术主要借助DNA限制性内切酶特性，切割已知HBV耐药突变并行PCR扩增，从而区分HBV耐药突变与非HBV耐药突变。其优势在于操作简便、一次性可检测大量突变、灵敏度和特异性均较高，但其优势也同样明显，即对于变异快速的HBV，无法及时制作针对性限制性内切酶，导致检测失败。此外，Ayres等[20]指出，若扩增产物可被限制性内切酶识别，则可能导致目标片段酶活性竞争，影响检测结果。
2.8 基质辅助激光解吸离子飞行质谱技术
基质辅助激光解吸离子飞行质谱（MALDI-TOF-MS）技术是近年来新兴的一种HBV耐药检测技术，其主要分析野生型HBV与变异型HBV间分子量差别，以明确耐药基因突变，其重复性、特异性、灵敏度均较高，但检测限仅为100 copies/mL，不及上述其他技术[21]。
2.9 其他技术
目前实验室明确HBV耐药株的方法多种多样，除上述8种技术外，还存在肽核酸分析技术、基因芯片技术、连接酶检测反应技术、线性探针杂交法、依赖转染细胞模型的表型耐药检测等[22-26]，为DNA直接测序的替代提供了新的方向，但各种技术也或多或少的存在一定缺陷，如肽核酸分析技术的突变株结果难以解释、基因芯片技术成本极高、连接酶检测反应技术检测限偏高、线性探针杂交法易漏检、依赖转染细胞模型仅可明确表型耐药但无法了解基因型耐药等。因此，如何综合上述技术的优势，尽可能寻求一种安全、经济、可靠、简便的检测方案，仍是医学工作者需要继续努力的方向。
3 展望
HBV耐药是乙型肝炎长期治疗中的最大难题，密切检测HBV耐药甚至多重耐药的发生，方为降低严重临床结局发生风险、改善患者预后质量的关键。当前关于抗病毒药物耐药的技术众多，且多数处于起步阶段，适用性、推广性均较为有限，对于各类现象、规律的认知亦不够完善。但各类技术在近几年已取得了飞速的发展，医学工作者亦朝着低成本、高通量技术方向不断努力，未来HBV耐药检测可着力于明确HBV耐药演变，了解HBV耐药发生发展关联。同时，随着耐药突变的早期检出，有望涌现出更多靶标抗病毒药物，为抗病毒治疗方案的个体优化、临床疗效的提升、患者预后的改善及HBV耐药株的减少提供更多可能性。
参 考 文 献
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