【摘要】 目的 系统分析方法评价酶联免疫斑点技术快速诊断潜伏结核的准确性。方法 通过检索PubMed、EMBASE、CNKI等数据库和其他方式收集文献。用Meta-Disc软件计算合并灵敏度、合并特异性和ROC曲线等评价T细胞斑点试验的诊断正确性。结果 终纳入6篇文献。酶联免疫斑点技术在检测潜伏结核时,均显示了较高的灵敏度,但特异性相对较低,且存在异质性。合并灵敏度=93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],合并特异性=合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],ROC曲线下面积为0.9658。结论 联免疫斑点技术诊断潜伏结核显示了较高的灵敏度,但特异性相对较差,限制了该方法的应用。
【关键词】 潜伏结核;分枝杆菌;诊断;酶联免疫斑点技术;系统分析
作者单位:330031南昌大学研究生院医学部(邹俊辉);深圳市慢性病防治中心(陶小华 关杨);江西省人民医院呼吸科(肖祖克)
人体感染结核分枝杆菌后,只有小部分可引起急性疾病过程,大部分则由于机体形成有效的免疫应答,阻止疾病的发展而成为无临床症状的潜伏感染状态[1]。控制结核病的一个重要措施,就是筛查出潜在性结核感染者并进行预防性治疗。有鉴于此,近年来该病的早期诊断成为一个研究热点[2]。免疫斑点(enzyme link immunospot,ELISPOT)试验的理论基础是当结核菌致敏的T淋巴细胞再次遭遇人型结核分枝杆菌抗原时,可在体内产生体外抗原诱导的干扰素-γ(INF-γ)[3]。目前,国内外已开展了多项ELISPOT检测分泌INF-γ的研究,但各家结果不尽相同。本研究旨在客观评价ELISPOT在潜伏结核快速诊断中的临床应用价值,结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 纳入标准 潜伏结核患者,痰涂片结核分枝杆菌阴性;以结核分枝杆菌培养为金标准;检测早期分泌抗原-6(early-secreted antigenic target 6,ESAT-6)的ELISPOT试验。
1.2 排除标准 纳入对象合并可导致免疫力下降的疾病,如HIV/AIDS;病例数<30例的研究;未设对照组的研究;结果中没有报告且通过计算不能得到四格表原始数据的研究。
1.3 文献检索及资料收集
1.3.1 检索词 tuberculosis, latent, Mycobacterium tuberculosis, interferon-gamma, ELISPOT, T-cell response, ESAT6, interferon gamma assay, sensitivity, specificity,结核,潜伏,结核分枝杆菌,干扰素-γ,酶联免疫斑点试验,T细胞应答,早期分泌抗原-6,干扰素-γ释放试验,敏感性,特异性。
1.3.2 检索策略 参考《The Bayes Library of Diagnostic Studies and Reviews》制定检索策略,检索词分目标疾病和诊断准确性指标两大部分,并根据具体数据库调整,所有检索采用主题词[MEDLINE (MeSH),EMATGE ( EMTREE) ]与自由词相结合的方式,所有检索策略通过多次预检索后确定。
1.3.3 数据库检索 PubMed (1966~2009-08、EMBASE (1974~2009-08)、Cochrane library (2009年第3期)。中国生物医学文献数据库(1978~2009-08)、中国期刊全文数据库(1979~2009-08)、中文科技期刊数据库(1989~2009-08)、中国重要会议论文全文数据库(2000~2009-08)、中国学术会议论文全文数据库(1998~2009-08)。
1.3.4 手工检索 检索创刊至今的《中华检验医学杂志》、《检验医学》、《临床检验杂志》、《上海医学检验杂志》、《中华微生物学和免疫学》、《中华结核和呼吸杂志》、《中华流行病学杂志》等相关杂志7种。
1.4 文献筛选 两名研究者独立阅读所获文献题目和摘要,在排除明显不符合纳入标准的研究后,对可能符合纳入标准的研究阅读全文,以确定是否真正符合纳入标准。两位研究者交叉核对纳入研究的结果,对有分歧而难以确定其是否纳入的研究,通过讨论或由第三位研究者决定。
1.5 资料提取 按照预先设计的资料提取表,一位研究者提取和录入资料,另一位核对,如遇意见不一致,双方讨论解决或由第三者判断,缺乏的资料通过电话或信件与作者联系予以补充。提取的主要资料包括:作者、发表年代、国家、试验方法、是否盲法、纳入样本数、参考标准与此法比较所得结果(灵敏度、特异性、优势比、似然比等)。
1.6 质量评价 根据Whiting等[4]制订的QUADAS量表14条标准评价文献质量(该量表为评价诊断性试验准确性文献质量的工具)。每一条标准以“是”、“否”、“不清楚”评价,“是”为满足此条标准,“否”为不满足或未提及,部分满足或者从文献中无法得到足够信息的计为“不清楚”。QUADAS量表是从偏倚、变异、报告质量三方面对纳入的每篇文献逐条进行评价,找出各种偏倚和变异产生的原因。
1.7 统计分析 用Meta-Disc软件(version 1.4)进行试验数据的统计学处理。对可提取四格表数据的文献,合并灵敏度、特异性、阳性似然比、阴性似然比、诊断性试验比值比,并进行异质性分析(Q检验,P),绘制ROC。
2 结果
2.1 文献检索结果 初检得到相关文献共84篇,经阅读题名及摘要后,排除了描述性研究、综述、动物试验等文献50篇,对筛选出的文献详细阅读全文,又排除了未设立对照等不符合纳入标准的文献28篇,最终纳入文献6篇。
2.2 纳入研究基本特征 纳入研究基本特征见表1。合并SEN为93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],Heterogeneity chi-squared = 4.16,P= 0.526;合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],Heterogeneity chi-squared = 64.95,P= 0.000。合并诊断比数比为40.289 [95% CI(15.11-107.46)],Heterogeneity chi-squared = 16.99,P= 0.005。
表1
纳入研究基本特征
文献序号作者及发表年份资料来源真阳性假阳性假阴性真阴性试验设计是否盲法文献质量
[5]Lee et al., 2006韩国83204111101
[6]Goletti et al., 2006意大利2113219101
[7]Janssens et al., 2007瑞士571271183101
[8]Kang et al., 2007韩国5939534102
[9]Soysal et al., 2008土耳其8020740102
[10]Zhao et al., 2009中国403347101
注:试验设计栏1表示病例对照研究,0表示横断面研究;是否盲法栏1表示盲法,0表示非盲法;文献质量栏按QUADAS量表由低至高分为1~3级
2.3 Meta分析结果
2.3.1 异质性检验 在诊断试验中,引起异质性的主要原因有阈值效应和非阈值效应。前者可通过ROC平面图来估计,当存在阈值效应时,灵敏度和特异度呈负相关(或灵敏度与1-特异度呈正相关),其结果在ROC曲线平面图上呈“肩臂状”点分布,反之则无。本研究的ROC平面图示ROC曲线不呈“肩臂状”分布(见图1)。非阈值效应可通过森林图和Cochran-Q检验来评价,本研究合并诊断比之比森林图示Cochran-Q=16.99,df=5,P=0.0045,表明存在非阈值效应引起的异质性(见图2)。
图1 ROC平面图
图2 合并诊断比之比森林图
2.3.2 合并统计量 通过计算灵敏度对数与(1-特异度)对数的spearman相关系数,发现b与0差异无统计学意义(P=0.2525),提示ROC曲线对称。拟合ROC曲线,同时给出AUC=0.9658,SE(AUC)=0.0229,Q=0.9123,SE(Q)=0.0353(见图3)。
图3 拟合ROC曲线图
3 讨论
潜伏结核感染是宿主感染结核杆菌后的一种亚临床状态,而大多数的活动性结核是未经治疗的潜伏感染的结核杆菌重新激活所致。潜伏结核患者因痰涂片镜检反复阴性易延误早期诊断和及时治疗,有效识别及治疗潜伏结核患者是防治结核的重要策略。据我国第四次全国结核流行病学抽样调查显示,65 %～75 %的患者为痰涂片阴性[11]。临床上用于判断潜伏结核分枝杆菌感染的经典方法是结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST),即皮内Mantoux试验以及PPD试验,但TST也存在难以克服的缺陷。首先,特异性不够好,对于卡介苗(BCG)作为常规接种疫苗的国家,TST的阳性或者弱阳性结果很可能是由BCG接种引起的,同时不能除外非结核分枝杆菌感染;其次,TST对潜伏性结核分枝杆菌感染的敏感性一般,对于免疫抑制者结果更是难以确定[12]。血清学方法检测结核抗体敏感性,特异性均不高,且与患者的营养状况及免疫功能相关。PCR(痰结核杆菌聚合酶链反应)具有快速,敏感性高,特异性强,但是假阳性高约20%~30%[13]。目前潜伏结核诊断的金标准是结核分支杆菌培养,特异性强,敏感性较低且耗时较长,给临床及时诊断结核病带来困难。
结核菌可诱导强烈的细胞免疫反应,因此,检测结核菌特异T淋巴细胞可作为检测感染的一种新途径。ESAT-6是由结核菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白,只存在于结核菌群(包括人型分枝杆菌、牛型分枝杆菌和洲型分枝杆菌)及其他几种致病性分枝杆菌,如堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、海分枝杆菌中,是T淋巴细胞的靶抗原,能诱导皮肤迟发型超敏反应并刺激胸水T淋巴细胞产生IFN-γ[14]。大量研究表明[15,16],结核特异性抗原分泌IFN-γ的T淋巴细胞可作为结核菌感染的一种可靠标志物。ELISPOT方法通过定量检测患者的全血/外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放IFN-γ的水平,该试验较为成熟,其对应的方法和试剂盒先后被美国FDA批准应用于临床,CDC也专门为其制定了使用指南[17]。通过分析纳入本研究的文献后,主要有如下发现:(1)采用ELISPOT检测潜伏结核感染时,显示了较高的灵敏度,合并SEN为93.9% [95% CI(90.9%-96.2%)],Heterogeneity chi-squared = 4.16,P= 0.526;然而,该试验的特异性较低,合并SPE为66.2% [95% CI(62.4%-69.8%)],Heterogeneity chi-squared = 64.95,P=0.000,且各家报道之间存在异质性。(2)通过拟合ROC曲线图给出,AUC=0.9658,Q=0.9123,且合并诊断比数比为40.289,提示ELISPOT具有高准确性,但SPE高度异质性,限制了该方法在诊断潜伏结核感染中应用。
收集的文献也存在一些不足之处,主要体现在:①有些文献没有提供ELISPOT检查方法的具体参数,如试剂、抗原剂量等;②部分文献在设置对照组时只将正常人纳入,而没有考虑其他疾病的患者;③读取检测数据时未遵循盲法,可能会导致偏倚,等等。有鉴于此,下一步研究的重点是设计更为严格的试验,结合卫生经济学展开经济-效果比研究,为指导ELISPOT检查方法提供更为全面、可靠的资料。
参 考 文 献
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