【摘要】 目的：探討肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌的疗效。方法：根据GenBank中Surivivin基因序列设计引物，在上下游引物5’端引入相应酶切位点，以HepG2基因组DNA为模板扩增Surivivin启动子基因片段。体外合成最小polyA转录中止信号，以pSUPER.retro.puro载体为媒介构建新的干涉载体pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP），完成干涉靶点的选取并完成干涉载体的构建和鉴定；建立细胞培养和转染及稳定转染细胞系，完成FAK RNAi的干扰效应性检测，进行体外细胞增殖及凋亡实验。结果：重组质粒完成DNA提取后，PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后获得1条预期大小的特异性皮带，质粒Surivivin启动子调控的FAK shRNA涉及符合要求。将目的片段与肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA慢性载体表达载体连接的阳性克隆序列，获得DNA序列证实含有目的序列片段，提示质粒构建成功；PCR仪结果显示：Surivivin启动子调控的FAK shRNA在肝癌细胞中表达水平较低，抑制率能达到73.33%；Western blotting法结果显示：转染后，与未转染的HepG2细胞相比，转染后肝癌细胞Surivivin含量明显下降；流式细胞仪结果表明：细胞转染后，肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA细胞凋亡率为24.39%，与未转染细胞的4.12%比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌可明显抑制肿瘤细胞的增殖，控制肿瘤的侵袭与转移。
【关键词】 肿瘤特异性； Surivivin启动； FAK shRNA； 靶向治疗
【Abstract】 Objective：To investigate the therapeutic effects of tumor specific Surivivin promoter targeting FAK and shRNA on hepatocellular carcinoma.Method：Primers were designed according to the Surivivin gene sequence in GenBank，and the corresponding restriction sites were introduced at the 5th and the end of primer DNA.The promoter fragment of Surivivin was amplified by HepG2 genomic DNA template.In vitro synthesis of polyA transcription termination signal to the minimum，pSUPER.retro.puro vector mediated interference vector pS-surP-shRNA-mpA （pS/surP），a new interference target selection and complete the construction and identification of interference vector.Establish the cell culture and transfection and stable transfection cell lines，to complete the interference effect of detecting FAK RNAi，cell proliferation and apoptosis experiments in vitro.Result：After DNA extraction，the recombinant plasmid was amplified by PCR，and 1 expected size specific bands were obtained by agarose gel electrophoresis.FAK shRNA regulated by plasmid Surivivin promoter met the requirement.FAK shRNA chronic carrier of the fragment and tumor specific Surivivin promoter and expression of positive clone sequence vector，DNA sequence was confirmed with the objective fragment，suggesting that plasmid was successfully constructed.PCR instrument showed that Surivivin promoter FAK shRNA in HCC cells expression level is low，the inhibition rate can reach 73.33%.Western blotting method showed：after transfection，compared with untransfected HepG2 cells，transfected Surivivin cells was significantly decreased.Flow cytometry results showed that FAK cells after transfection，shRNA cell apoptosis of tumor specific Surivivin promoter was 24.39%，and there was significant difference compared with 4.12% of non transfected cells（P<0.05）.Conclusion：Tumor specific Surivivin promoter targeting FAK shRNA targeting HCC can significantly inhibit the proliferation of tumor cells and control tumor invasion and metastasis.
【Key words】 Tumor specificity； Surivivin promoter； FAK shRNA； Targeted therapy
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.007
原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，而我国是原发性肝癌发病率较高的国家[1]。有报道显示，我国每年恶性肿瘤发病率为35万，每年死亡人数约32万，严重影响我国居民健康与生活[2]。目前，临床上对于原发性肝癌以手术、放化疗及介入等治疗为主，这些方法虽然能改善患者症状，但是长期疗效欠佳，不能从根本上改善患者的预后[3-4]。随着医疗技术的不断发展，分子生物技术为生物方法治疗肝癌提供了新的方法[5]。为了探讨肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌。本课题从外源性基因为起点，完成细胞的分离鉴定，并进行体外、体内试验，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 仪器与试剂 本课题中主要仪器和试剂主要为RT-PCR试剂盒、倒置相差显微镜、流式细胞分选仪、荧光定量PCR仪及BCA-100蛋白质定量测定试剂盒等，相关试剂和仪器厂家如下，见表1。
1.2 方法 （1）根据GenBank中Surivivin基因序列设计引物，并分别在上下游引物5’端引入相应酶切位点，以HepG2基因组DNA为模板扩增Surivivin启动子基因片段。体外合成最小polyA转录中止信号，将pSUPER.retro.puro作为媒介完成心载体pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）的构建[6]。（2）干涉靶点的选取：在相关基因库中确定FAK基因序列，并根据相关要求完成两对siRNA寡聚脱氧核苷酸序列的设计，以一组经处理后无同源性的siRNA作为对照。（3）干涉载体的构建和鉴定：将以人FAK基因为靶序列设计的siRNA寡核苷酸链的退火后，与构建好的Surivivin启动子调控的真核表达载体pS-surP-shRNA-mpA（pS/surP）连接，构建重组的短发卡状shRNA真核表达载体，通过筛选、测序对插入pS/surP中的干涉序列进行鉴定，并分别命名为：pS/surP-FAK/shRNA1、pS/surP-FAK/shRNA2、
pS/surP-NS（Non-Specific siRNA）[7-8]。（4）细胞培养和转染及稳定转染细胞系的建立：将人肝癌细胞系HepG2放置在培养箱中进行4～5 d培养，设置培养箱条件：37 ℃、5%CO2，隔日换液。在转染前去适当对数生长的细胞接种在24孔培养板中，待细胞贴壁90.0%以上后开始转染。转染完毕后再次利用600 μg/mL的G418抗生素进行筛选，约2周后待大部分细胞死亡，并有阳性克隆长出时，导致显微镜下观察单个细胞克隆情况；持续利用100μg/mL的G418抗生素完成1个月筛选，冻存[9]。（5）FAK RNAi的干扰效应检测：稳定转染细胞系分别命名如下：HepG2-s1、HepG2-s2、HepG2-NS。用RT-PCR法检测各组细胞及未转染的HepG2细胞中FAK mRNA的表达水平。Western blotting法检测各组细胞及未转染的HepG2细胞中FAK蛋白的表达水平。（6）体外细胞增殖及凋亡实验：通过水溶性四唑盐（WST-1）比色法来检测细胞活力，流式细胞仪技术（FCM）检测细胞周期的变化，流式细胞仪技术（FCM）检测细胞凋亡率的变化，TdT-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）染色法检测细胞凋亡，对稳定转染或者未转染的HepG2细胞进行Caspase-3活性分析比较[10-11]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒的PCR扩增鉴定及序列测定 （1）PCR扩增鉴定。重组质粒完成DNA提取后，PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后获得1条预期大小的特异性皮带，质粒Surivivin启动子调控的FAK shRNA涉及符合要求，见图1。（2）序列的鉴定。将目的片段与肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA慢性载体表达载体连接的阳性克隆序列，获得DNA序列证实含有目的序列片段，提示质粒构建成功，见图2。
2.2 体外细胞增殖及凋亡实验 （1）RT-PCR检测转染中Surivivin启动子调控的FAK shRNA表达。PCR仪结果显示：Surivivin启动子调控的FAK shRNA在肝癌细胞中表达水平较低，抑制率能达到73.33%，见图2。（2）Western blotting法检测转染及未转染的HepG2细胞中FAK基因调控蛋白。转染后，未转染的HepG2细胞相比，转染后肝癌细胞Surivivin含量明显下降，见图3。
2.3 流式细胞仪技术（FCM）检测细胞凋亡率 流式细胞仪结果表明：细胞转染后，肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA细胞凋亡率为24.39%，与未转染细胞的4.12%比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。
3 讨论
肝癌是临床上常见的疾病，在不同年龄段均可发病，且多發生在中老年人群中，患者由于年龄较大，机体免疫相对较低，再加上长期伴有乙型肝炎、饮酒史等，加剧疾病的发展。肝癌发病早期临床症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊，已经是中、晚期，延误了最佳治疗时机。因此，临床上如何采取有效的措施提高肝癌患者治疗效果对改善预后具有重要的意义[12-13]。
随着医疗技术的不断发展，人们对于原发性肝癌的研究已经深入到基因水平，再加上“基因沉默”技术的发展及利用，为肝癌的分析靶向治疗提供了新的方法[14-15]。本课题中以siRNA为基础完成相关基因片段的感染，能有效地抑制靶基因基因表达水平及活性，能在一定程度上对肿瘤细胞的增殖、生长发挥干扰。目前，临床上对于肝癌的治疗中RNAi 主要由RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子调控等构成，这些放大虽然能延缓病情发展，但是对于肿瘤细胞的抑制缺乏特异性。Surivivin属于是一种细胞凋亡抑制因子，在正常人体中Surivivin表达水平相对较多，且多存在于胚胎细胞[16-17]。对于肝癌患者发病后机体免疫将迅速发挥作用，导致Surivivin水平得到迅速上升，并且在肿瘤细胞中均可表达，能够选擇性地在癌组织中激活其后的外源基因的转录，减少对正常细胞的损伤。国内学者扩增了Surivivin基因翻译起始位点上游约0.4 kb的片段，证实Surivivin在肝癌细胞中具有转录活性[18]。同时发现在肝癌细胞系中，Surivivin启动子活性相当高，是AFP启动子活性的数十倍。由此可以看出：在肝癌的靶向性基因治疗中，Surivivin启动子能够有效的启动目的基因的表达，它比AFP启动子具有更强的转录活性。本研究拟利用肿瘤特异性Surivivin启动子在肿瘤细胞内高转录调控活性而在正常细胞内转录调控活性几乎为零的特性，构建肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK RNAi真核表达质粒，实现Surivivin启动子调控的RNA干涉系统特异性的封闭肿瘤内源性FAK基因表达[19]。将肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌中能积极有效的控制肿瘤的侵袭和转移，能为临床原发性肝癌的治疗提供新的思路和方法，延长患者寿命，促进患者早期恢复[20]。
综上所述，肿瘤特异性Surivivin启动子调控的FAK shRNA靶向治疗肝癌可明显抑制肿瘤细胞的增殖，控制肿瘤的侵袭与转移，能为肝癌的治疗提供新的思路和方法。
参考文献
[1]田伟，郑克彬，何心，等.shRNA干扰Surivivin基因后胶质瘤细胞中Survinvin及mcm2的表达及意义[J].脑与神经疾病杂志，2015，23（1）：24-29.
[2] Zhang J，Zhu Z，Sun Z，et al.Surivivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels[J].Mol Med Rep，2014，9（2）：600-606.
[3]陶燕，付生军，洪梅，等.靶向Surivivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响[J].暨南大学学报自然科学与医学版，2015，36（3）：239-245.
[4]易梅，李吉，栗娟，等.RASSF1A对黑色素瘤A375细胞基因网络的影响[J].生物化学与生物物理进展，2014，41（4）：352-362.
[5]吴发宗，纪建松，应希慧，等.射频消融联合放射性125I粒子植入治疗多结节型原发性肝癌疗效分析[J].中华医学杂志，2016，96（9）：693-696.
[6]张远标，洪德飞，黄东胜，等.经皮微波或射频消融肝实质分隔联合门静脉栓塞计划性肝切除术治疗肝硬化肝癌[J].中华消化外科杂志，2016，15（5）：510-514.
[7]唐荣，胡仁健，魏来.手术切除联合射频消融治疗肝癌的临床研究[J].重庆医学，2015，44（20）：2844-2847.
[8] Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Dowegulation of Surivivin by shRNA inhibits Invasion and enhances the radiosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma[J].Cell Biochem Biophys，2015，72（1）：251-257.
[9]谷毅博，刘萍，杜海燕，等. Surivivin与卵巢癌相关性的研究现状[J].中国医学创新，2015，12（28）：149-152.
[10]朱俊，袁玉林，彭涛，等.Cdc2/cdk1和Surivivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定[J].海南医学院学报，2015，21（3）：291-295.
[11]王健.Surivivin基因多态性与结直肠癌发病风险的相关性分析[J].中国医学创新，2016，13（14）：7-10.
[12] Hu J，Pan J，Luo Z，et al.Dowegulation of Surivivin by shRNA Inhibits Invasion and Enhances the Radiosensitivity of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma[J].Cell Biochemistry and Biophysics，2015，72（1）：251.
[13]乐雄，杨德同，张洪海.胃癌干细胞对氟尿嘧啶敏感性及化疗药物耐受细胞的生物学机制[J].中国组织工程研究，2015，19（19）：3022-3026.
[14]杨斌，邓立欢，李秉航.角质细胞生长因子及氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中的信号通路[J].中国组织工程研究，2014，18（19）：3060-3068.
[15]张瑞，刘明.球形多孔微载体支持下高密度培养人肝细胞L-02的定时形态变化（英文）[J].中国组织工程研究，2015，19（12）：1924-1930.
[16]康从利，徐日，徐风亮，等.血清肿瘤标志物的联合动态检测在原发性肝癌诊断中的价值[J].肿瘤研究与临床，2014，26（8）：531-534.
[17]韩素桂，黄彩云，李世龙，等.甲胎蛋白异质体联合甲胎蛋白、高尔基体蛋白73在原发性肝癌中的诊断价值研究[J].标记免疫分析与临床，2016，23（2）：156-157.
[18]施明明，黄桢翔，杨月，等.高尔基体糖蛋白73联合甲胎蛋白L3诊断原发性肝癌的荟萃分析[J].中华肝脏病杂志，2015，23（3）：189-193.
[19]万豪光，徐浩，顾玉明，等.GP73和AFP单项与联合诊断对原发性肝癌诊断应用的Meta分析[J].中华检验医学杂志，2014，22（5）：357-361.
[20] Chen Q W，Li H J，Chen Y N，et al.Hepatic Lesions Detected after Mastectomy，in Breast Cancer Patients with Hepatitis Background May Need to Undergo Liver Biopsy to Rule Out Second Primary Hepatocellular Carcinoma[J].PLoS One，2016，11（1）：397-399.
（收稿日期：2017-06-12） （本文编辑：程旭然）
