[摘要] 目的 寻找乙型肝炎病毒特异性的miRNA，并在体内验证找到的miRNA的功能，从而为阻断乙肝进一步发展提供新方法。 方法 利用miRNA芯片分析3对正常肝臟组织与慢性乙型肝炎组织的miRNA，寻找两者之间差异表达的miRNA。用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR，RT-PCR）在更多的组织标本中验证差异表达，确定有意义的miRNA。在鼠病毒性肝炎模型中通过静脉注射有意义的miRNA或anti-miRNA进行干预，同时刺激向肝癌方向转变，观察其病毒复制情况。 结果 与正常肝脏组织相比，慢性HBV病毒感染组织中表达上调的miRNA 有8 个，表达下调的miRNA 有16个。miR-143在肝癌组织中的表达降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌组织中的表达提高（P=0.0320）。 结论 miRNA在乙型肝炎的发生、发展中起重要作用，其功能的失调可能导致其最后发展成为肝硬化甚至肝癌，并且可以影响乙型肝炎治疗效果。
[关键词] 乙型肝炎病毒；miRNA；HBV感染；筛选；功能
[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）17-0035-03
Screening and functional study of specific miRNA of HBV infection in hepatitis B patients
GE Wentao1 XIONG Ying2 WANG Huazhong2
1.First Department of Medicine， the People"s Hospital of Wuyuan in Jiangxi Province， Wuyuan 333200， China； 2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330000， China
[Abstract] Objective To find the specific miRNA of hepatitis B virus and verify the functions of the miRNA in vivo， so as to provide a new method for blocking the further development of hepatitis B. Methods We used miRNA chips to analyze the miRNA of 3 pairs of normal liver tissues and chronic hepatitis B tissues， and found the different expression of miRNA. Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to verify the different expression in more tissue samples to identify significative miRNA. Intervention by intravenous injection of the significative miRNA or anti-miRNA in the viral hepatitismodels of rat was done. At the same time， we stimulatedthem to turn into liver cancer and then observed the replication of the virus. Results Compared with normal liver tissue， 8 miRNAs were up-regulated in chronic HBV-infected tissues， and 16 miRNAs were down-regulated. The expression of miR-143 was decreased in hepatocellular carcinoma（P=0.0029）， and the expression of miR-520d-5p in hepatocellular carcinoma was increased（P=0.032）. Conclusion miRNA plays an important role in the incidence and development of hepatitis B. The dysfunction of it may lead to the final development of liver cirrhosis and even liver cancer， and it can affect the therapeutic effect of hepatitis B.
[Key words] Hepatitis B virus； miRNA； HBV infection； Screening； Function
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种小的双链DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，是已知的感染人类最小的双链DNA病毒。HBV感染已经成为一个全球性问题。到2010年，已报道2.48亿人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性，并且尽管存在有效的疫苗，病毒导致每年约780 000例死亡，据估计，约15%～30% HBV携带者有发展为肝硬化的风险[1]。
微小RNA是一个长约23nt的非蛋白编码小分子单链RNA，是进化中保守的内源性核酸，通过RNA的作用机制与靶基因的3’UTR结合，在转录后调节基因的表达，即调控翻译或对靶蛋白直接剪接。miRNA參与所有生物过程中复杂调节网络和控制基因表达，包括细胞发育、免疫反应、衰老和细胞死亡。到目前为止，已有1881种前体及2588个成熟人miRNA注册（miRbase version 21.0）[2]。本实验通过筛选乙型肝炎病毒特异性的miRNA，并在大鼠体内验证，从而了解miRNA的功能。
1 材料与方法
1.1 材料来源
随机选取2011年9月～2012年3月至我院消化内科行肝组织活检的慢性HBV病毒感染和正常肝脏标本各27例。慢性HBV病毒感染诊断依据2015年中华医学会肝病学分会发布的《慢性乙型肝炎防治指南》[3]：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是指HBsAg 和（或）HBV-DNA 阳性6个月以上。正常肝脏组织是指：既往及住院过程中检查无肝脏疾病。慢性HBV病毒感染组患者的平均年龄（39.4±6.5）岁（年龄范围28～52岁），其中男17例，女10例，正常肝脏组织组患者平均年龄（40.9±6.9）岁（年龄范围27～61岁），其中男21例，女6例，所有组织标本离体后立即放入液氮冷藏， 后转入-80℃保存。
动物选取：在南昌大学医学院动物实验中心挑选携带拷贝HBV全基因组序列成年Tg小鼠共88只，体重17～25 g，清洁级别Ⅱ级，雌雄各44只，每只小鼠均无缺陷，且发育良好。
1.2 方法
1.2.1 提取组织中总RNA 选取3对年龄在30～40岁男性的慢性HBV病毒感染和正常肝脏组织，运用TRIzol试剂（Invitrogen life technologies）将3对组织中的总RNA逐步提取出来，在此过程中严格依据说明书步骤。测其A260值和A280值，A260/A280比值检测纯度，在此过程中充分利用紫外分光光度计。
1.2.2 miRNA芯片分析两组组织miRNA表达差异 分别取5 μg从两组3例肝脏组织中提取的总RNA，用Affymetrix购买的miRNA 基因表达谱芯片Gene Chip miRNA（4.0版）进行分析。对各个芯片的每个探针数据进行标准化处理（即原始值与背景值的差值，中值做标准化），计算出差异表达的miRNA。
1.2.3 差异性miRNA反转录 按照TAKARA逆转录试剂盒说明书逐步加入试剂，用差异性miRNA特异性引物合成cDNA，总反应体系为20 μL。
1.2.4 用RT-PCR定量分析成熟的miRNA，确定有意义的miRNA 成熟miRNA表达用U6基因做标准化，用2-ΔΔCT方法计算miRNA表达水平。
1.3 观察指标
详细记录miRNA基因芯片3对慢性HBV病毒感染和正常肝脏组织中miRNA表达情况，同时，用RT-PCR在扩大样本中验证以上有差异表达的miRNA。此外，对miR-143和miR-520d-5p在肝癌和正常肝组织中的表达情况进行观察。
1.4 统计学分析
使用SPSS 17. 0统计学软件，计量资料采用t检验，检验水准α=0.05，最终确定差异miRNA。
2 结果
2.1 miRNA基因芯片分析3对慢性HBV病毒感染和正常肝脏组织中miRNA表达情况
提取3对慢性HBV病毒感染和正常肝脏组织中的总RNA，紫外分光光度计测 A260/A280比值为2.2，提取的RNA样品纯度可用GeneChip miRNA芯片筛选差异表达的miRNA，以2 倍差异变化有意义标准，与正常肝脏组织相比，慢性HBV病毒感染组织中表达上调的miRNA 有8 个，表达下调的miRNA 有16个（表1）。
2.2 miR-143和miR-520d-5p在肝癌和正常肝组织中的表达情况
用RT-PCR在样本中验证以上miRNA表达情况，如miR-143和miR-520d-5p在肝癌组织平均表达水平分别是5.04×10-2（范围1.47×10-3～2.9×10-1）和5.69×10-6（范围2.14×10-8～3.15×10-5）。在配对的正常肝组织中，miR-143和miR-520d-5p表达水平分别是1.24×10-1（范围5.37×10-3～7.86×10-1）、3.49×10-6（范围2.43×10-8～ -3.34×10-5），证明miR-520d-5p在慢性HBV病毒感染组中表达上调，miR-143在慢性HBV病毒感染组中表达下调，差异有统计学意义。miR-143在肝癌组织中的表达降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌组织中的表达提高（P=0.0320）。
3 讨论
miRNA属于一类成熟状态下非编码单链小RNA，只有约23nt，在从线虫、动物、人类等多种生物中广泛存在，由于其一方面在个体生长发育中发挥着极为重要的作用，另一方面在细胞增殖凋亡、炎症及肿瘤等中发挥着极为重要的作用，因此得到了临床充分重视[4]。第一个miRNA（lin-4）由Duetal在线虫中发现[5]，近年来，共有约9539个miRNA从103个左右的物种中被发现，其中约706个从人类中被发现[数据来源于http：//miRNA.sanger.ac.uk/sequences/（Sanger miRBase 13.0）]，据估计，这些miRNA可能对人类30%及以上的基因进行调控[6]。大量相关医学研究表明[7-10]，多种人类肿瘤均具有异常的miRNA表达，如胰腺癌中miR-221表达上调、肺癌中的let-7表达下调等，说明在肿瘤的发生发展中，miRNA可能将类似抑癌基因或癌基因的作用发挥出来。正常情况下，成熟的miRNA参与正常细胞稳态的维持，途径为对靶基因miRNA的稳定性或翻译进行调控，因此如果miRNA表达异常，则其相应靶基因转录后就可能具有异常的表达水平[11-15]。
本研究通过适时定量PCR检测及miRNA芯片检测发现，一些miRNA在HBV相关性肝癌及乙型肝炎肝硬化组织中比正常人类肝脏组织具有显著较高的表达，说明在HBV感染-肝硬化-肝癌的发生发展过程中，这些差异性表达于不同类型肝脏组织中的miRNA可能发挥着类似抑癌或癌基因的作用。用GeneChip miRNA芯片筛选差异表达的miRNA，以2 倍差异变化有意义标准，与正常肝脏组织相比，慢性HBV病毒感染组织中表达上调的miRNA 有8个，表达下调的miRNA 有16个。慢性HBV病毒感染和正常肝脏组患者的年龄及性别均无统计学差异，用RT-PCR在样本中验证以上miRNA表达情况，如miRNA143和miR-520在肝癌组织平均表达水平分别是5.04×10-2（范围1.47×10-3～2.9×10-1）和5.69×10-6（范围2.14×10-8～3.15×10-5）。在配对的正常肝组织中，miRNA143和miR-520表达水平分别是1.24×10-1（范围5.37×10-3～7.86×10-1）、3.49×10-6（范围2.43×10-8～-3.34×10-5），证明miRNA-520在慢性HBV病毒感染组中表达上调，miRNA-143在慢性HBV病毒感染组中表达下调，差异有统计学意义。miR-143在肝癌组织中的表达降低（P=0.0029）；miR-520d-5p在肝癌組织中的表达提高（P=0.0320）。
综上，HBV感染-肝硬化-肝癌进程中，miRNA表达的改变可能是始动因素，相关miRNA表达的改变可能为该进程的发生发展提供了良好的前提条件。
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（收稿日期：2017-11-21）
