[摘要]目的：探讨自体表皮细胞悬液促进Ⅲ度烧伤创面愈合的机制。方法：应用切削皮法结合胰蛋白酶技术获得自体表皮细胞悬液，皮下注射到Ⅲ度烧伤创面基底后观察大鼠Ⅲ度创面愈合率和创面愈合效果。结果：实验组自体表皮细胞悬液制作整个过程约1h 内即可完成。实验组2和3周创面愈合率明显高于对照组（P<0.01，P<0.05）。实验组4周创面愈合后颜色和质地均明显优于对照组（P<0.05）。结论：改进的自体表皮细胞悬液技术可操作性强，具有快速、简便、经济等优点，是治疗Ⅲ度烧伤创面的良好方法，其主要机制是表皮细胞去分化促进皮岛形成。
[关键词]表皮细胞；悬液；细胞活力；三度烧伤；表皮去分化
[中图分类号]R644 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）23-1978-03
Abstract： Objective To investigate the mechanism of improved epidermal cell suspension to treat full-thickness degree burns. Methods Epidermal cell suspension was made with an improved method. The cure rate and quality after epidermal cell being injected were evaluated in rats with full-thickness degree burns. 30 rats were divided into control and therapy groups. Each group includes 15 rats. Results It took one hour to acquire epidermal cell suspension. Cure rate of therapy group at 2 and 3 weeks was significantly higher than that of control group（P<0.01，P<0.05）. The quality of skin in therapy group was also significantly better than that of control group at 4 weeks（P<0.05）. Conclusion It is a simple， easy and economical way to acquire epidermal cell suspension. Full-thickness burns of rats could be healed with it.
Key words：epidermal cell；suspension；cell viability；full-thickness degree burns；epidermal dedifferentiation
自异体表皮移植技术成功挽救了大量烧伤及皮肤缺损患者，但是大面积深度烧伤患者的供皮区有限问题，以及供皮区感染、瘢痕和色素异常等并发症迫使临床医生不断寻找新方法，从而能够以较小的供皮区修复较大的创面，并减少供皮区并发症。1975年培养自体表皮细胞获得成功是一个重要突破，已经在临床得到应用[1-5]。因为传统的培养自体表皮细胞技术需要专业的实验室，存在操作复杂和价格昂贵的缺点，并且细胞培养还需要有一定的时间延后，因此临床应用尚不满意。而异体表皮移植，由于免疫排斥反应存在，只能作为暂时封闭创面的一种方法，加上伦理问题日渐突出导致异体皮来源紧张，价格不断升高，使得其临床应用日益受限。值得注意的是近年来，未培养的自体表皮细胞悬液技术得到了快速发展，成为国内外研究的热点[4-9]。本研究采用改进方法制取自体表皮细胞悬液，观察到其促进大鼠Ⅲ度烧伤创面愈合。
1 材料和方法
1.1 动物分组与烧伤模型制作：健康Wistar大鼠30只，雌雄各半，200～300g，随机分为对照组和实验组，每组15只。大鼠术前禁食6h，腹部皮肤消毒后，10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉。剔除背部鼠毛，在脊柱两侧各形成约3cm×3cm无毛区，用胶带粘贴四周。无毛区暴露充分。95℃热水直接倾倒于无毛区内实验区，时间约15s，造成Ⅲ度烧伤模型。伤后10min，生理盐水10ml腹腔注射。单笼饲养，每日伤口清洁消毒，每日予氨苄青霉素4万单位肌注。对照组和实验组每只大鼠背部正中线两侧形成2个创面分别为取皮区和实验区（Ⅲ度创面）。烧伤后第4天，全麻下行三度创面切痂术，直至深筋膜浅层，彻底止血后，5ml注射器经创缘正常皮肤下注射自体表皮细胞悬液到创面基底，无菌凡士林油纱及敷料包扎[10]。
1.2 自体表皮细胞悬液的制备：大鼠背部取皮区碘伏常规消毒3次，设计切取皮片范围1.0cm×1.0cm，皮下注射生理盐水使供皮区皮肤明显肿胀并形成一个相对的平面，取无菌一次性剃须刀片，中号直血管钳夹刀片，切下表皮，取皮片的厚度在切削时应密切观察。或者辊轴取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理盐水浸洗3遍备用，供皮区创面用无菌凡士林油纱及敷料加压包扎。无菌条件下，将浸洗后皮片放入无菌容器中，组织剪简单剪碎皮片至直径0.5～1.0mm大小，加入适量无菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，离心收集表皮细胞悬液，台盼蓝法测定细胞活力。观察移植后的创面1周，2周，3周和4周创面愈合率[创面愈合率=（已经愈合创面面积/原创面面积）×100%]。两个观察者应用视觉评分法评价创面愈合效果包括颜色和质地。
1.3 统计学方法：应用SPSS16，0统计软件，创面愈合率的比较和计数资料分析采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 无菌条件下，表皮细胞悬液整个制取过程约1h，无需特殊设备。制取的自体表皮细胞悬液活细胞率均高于95%，含有表皮细胞密度为1.5～2.0×106/ml。
2.2 实验组移植后5～7天创面可见皮岛出现，皮岛呈离心性生长，逐渐与向心性生长的周边皮肤融合。12～14天，创面的皮岛之间及创缘上皮接触，表皮细胞进一步成熟和分化，创面愈合良好。19～21天表皮层逐渐增厚，有一定程度色素沉着。4周时色素沉着明显减退，新生皮肤上皮层较厚“柔软”、“耐摩擦”有一定弹性，外观较接近鼠脱毛后的正常皮肤。对照组大鼠创面有一定程度收缩， 10～14天可见肉芽组织形成，创缘上皮向心性生长，有较多渗出液。18～20天创面愈合再上皮化，创面上形成薄薄的上皮，伤口表面覆盖新鲜细嫩的表皮组织。4周新生皮肤上皮层薄，易破溃，皮肤弹性差。
2.3 创面愈合率（表1） 实验组2周和3周创面愈合率明显高于对照组（P<0.01）。
2.4 创面愈合效果（表2）。实验组4周创面愈合后颜色和质地均明显优于对照组（P<0.05）。
3 讨论
自体表皮细胞悬液根据制取方法可分为未培养自体表皮细胞悬液和培养后自体表皮细胞悬液。传统方法操作复杂，需要专业的实验室，并且培养细胞需要2～3周时间，因此在临床应用收到了较大的限制，但因为节约供皮区的优点，仍然在临床得到应用[4-5]。
自体表皮细胞悬液在临床应用目前有两种方法：一步法和二步法[6-9]。一步法是指自体表皮细胞悬液直接应用于经过清创后相对无菌的创面上。二步法是指首先在清创后相对无菌创面上移植脱细胞真皮基质，待其实现基质血管化后再次手术应用自体表皮细胞悬液。本研究采用一步法，应用自体表皮细胞悬液修复创面，具有操作简单，节约供皮区面积的优点。
自体表皮细胞悬液在创面有多种应用方法，例如刷子，注射器或者仪器喷射到创面均有报道，但创面皮下注射方法未见报道。前几种方法存在自体表皮细胞悬液的无序流动会导致创面应用自体表皮细胞悬液不均匀，术后需要一定时间内限制活动等缺点。本研究采取了创面下注射，这与表皮细胞悬液直接应用创面相比，操作方便，修复创面部位可自由选择，自体表皮细胞分布均匀而且不用术后限制活动[10]。
皮岛的形成在创面愈合过程中有着至关重要的作用，这是因为创面内皮岛的数量不但直接影响创面愈合速度，而且对于创面愈合质量也有关键作用。已有研究表明皮岛的来源主要有：一是创伤后皮肤干细胞残留； 二是表皮细胞去分化为皮肤干细胞。因为本实验是三度烧伤创面，创伤后皮肤干细胞残留可以忽略不计。由于在皮肤损伤后成纤维细胞明显增生会一方面导致胶原蛋白合成明显增加促进创面愈合，另一方面分泌大量的成纤维细胞生长因子，已有研究表明成纤维细胞生长因子能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型表皮前体干细胞[11]。进一步的研究表明，创面内Wnt/β-catenin通路活化可引起人成熟表皮细胞的去分化[12]。本实验表明，在表皮细胞移植后形成人造皮岛，从而促进实验组创面皮岛较多的早期形成，其可能的机制为成熟表皮细胞悬液注射到创面下后，在创面内炎症因子及成纤维细胞等其他细胞因子通过旁分泌途径的刺激下，发生去分化成为增殖能力强的细胞，促进形成皮岛，并逐渐扩展，从而促进创面愈合。实验组14天创面愈合率明显高于对照组（P<0.01）， 这说明应用表皮细胞悬液可以促进创面愈合，而且创面愈合后的颜色和质地均明显优于对照组（P<0.05）。
综上所述，改进的自体表皮细胞悬液具有快速、简便、可操作性强、经济等优点，是一种治疗深度烧伤创面和皮肤缺损类疾病的良好手段，其主要机制是表皮细胞去分化促进皮岛形成。
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[收稿日期]2014-10-28 [修回日期]2014-12-11
编辑/张惠娟
