【摘 要】目的：分离培养儿童乳牙牙髓基质细胞，比较研究矿化诱导前后钙盐形成的差异。方法：牙髓取材自10名8～10岁儿童拔除的滞留乳磨牙，通过组织块贴壁法获得乳牙牙髓基质细胞，并在含体积分数10%FBS的DMEM培养基中原代培养14d，消化传代后用添加有10 mol/L地赛米松，50mg/L左旋抗坏血酸，10nmol/L维生素D3，10mmol/Lβ-磷酸甘油钠的DMEM培养基诱导培养14天，观察细胞形态变化和生长规律，通过茜素红染色比较诱导前后钙盐形成的能力。结果：乳牙牙髓基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长，经矿化诱导14天后细胞由梭形转变成多角形和柱形，胞核大而圆，形成了钙化结节。而未经诱导的细胞仍为梭形，未见钙化结节的形成。结论：乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养后可以在体外形成钙化结节，可以尝试作为组织工程牙再生研究新的种子细胞。
【关键词】乳牙；牙髓；基质细胞；细胞培养；矿化
【中图分类号】R780 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0164-02
牙齿作为颌面部特殊的独立器官，其修复一直为人们所关注，而现有的临床方法实在不尽人意。国内外学者多致力于应用组织工程技术进行牙再生的研究，其中一项重要的工作就是寻找合适的种子细胞[1]。牙髓细胞是当前研究的中心，过去对于人牙髓细胞的研究主要集中于恒牙牙髓的研究，本试验拟通过培养人类乳牙牙髓细胞，为研究乳牙牙髓特性、乳恒牙替换和发育等奠定基础，并摸索乳牙牙髓基质细胞向成牙本质细胞分化的诱导条件，为牙再生找寻新的种子细胞。
材料和方法
1.材料与设备
地塞米松，L-抗坏血酸，β-磷酸甘油钠，维生素D3（以上试剂购自美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS），DMEM培养基，胰酶-EDTA，HEPES（以上试剂购自美国Gibco公司）。CO2细胞培养孵箱（美国Forma公司），超净工作台（苏州净化总厂），低温高速离心机（德国Heraeus公司），倒置显微镜（美国Olympus公司）。
2.乳牙牙髓基质细胞的分离及原代培养：乳牙来自临床上拔除的滞留松动乳牙，供体为10名8～10岁儿童，排除传染病及内分泌疾病史，乳牙排除牙体牙髓疾病。离体乳牙立即置于含抗生素（青霉素500U/ml，链霉素500mg/ml）的DMEM培养液中，在超净工作台内用生理盐水冲洗后，75%酒精擦拭，无菌条件下取出牙髓组织，将牙髓组织剪成1mm3大小碎块，均匀铺于无菌的培养瓶底，加入10%FBS的DMEM培养液于37℃，5%CO2条件下孵育。
3.乳牙牙髓基质细胞的矿化诱导培养：用0.53mmol/L的EDTA及质量分数为0.05%胰酶消化贴壁的乳牙牙髓基质细胞，3～5min后用含体积分数为10%FBS的DMEM培养基中和胰酶，300g离心3×5min以充分清除EDTA残余，再用DMEM培养基（内含体积分数为10%FBS， 10 mol/L地塞米松，50mg/L左旋抗坏血酸，10nmol/L维生素D3及10mmol/L β-磷酸甘油钠）培养细胞，对照组仅用DMEM培养基。
4.诱导前后茜素红染色比较：将诱导后的牙髓基质细胞爬片用茜素红S染液染色5min，丙酮速洗，二甲苯透明，置于光学显微镜下观察钙盐分泌情况。
结果
1.乳牙牙髓基质细胞原代培养：
乳牙牙髓组织块贴壁后2天开始有细胞爬出，以组织块为中心呈放射状排列，细胞增殖极快，约10d可达80%融合。贴壁的细胞大部分呈梭形的单层成纤维细胞样细胞，胞体细长、伸展良好、胞浆均匀、核圆、核仁清晰，其间也可见形态、体积不一的多种细胞成分。细胞传代后可见部分细胞呈克隆样生长。
2.乳牙牙髓基质细胞矿化诱导培养后茜素红染色：
传代的乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养5～7d，倒置显微镜下观察其形状由细长梭形转变成棱形或多角形，细胞浆丰富，细胞排列呈一定的极性，并有少数细胞有细长的突起。诱导21天后，可见部分细胞聚集形成结节状，茜素红染色结果呈强阳性，可见细胞内外有呈淡红色，结节处呈深红色，提示诱导后细胞可以形成钙盐沉积。而对照组未诱导的牙髓基质细胞未见矿化结节的形成。
讨论
牙齿作为颌面部独特的器官之一，无论对于人体的功能还是美观都具有重要的意义，而牙齿的缺损或缺失更是极为普遍，它的修复一直为人们所关注，而现有的治疗和修复方法实在不能令人满意。近年来国内外学者一直地寻找合适的种子细胞，1999年Harada等以鼠的切牙为模型，发现鼠切牙根尖处颈环的星网层存在有干细胞；2000年Gronthos等在体外成功培养并鉴定了人牙髓干细胞；Young等报道猪的牙胚组织中存在有上皮和间充质干细胞；牙髓干细胞的发出及概念的确立有助于我们从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制，并使人们看到利用组织工程实现牙齿再造可能性[2]。
自体牙相关干细胞的研究一直集中在成体牙髓和牙周细胞，近年国外有关于乳牙牙髓细胞培养的报道[3]。国内培养人牙髓细胞的成功率较低，约8%左右，极大地影响其实用性。本实验培养的牙髓组织来源于临床拔除之松动乳牙，因此必须将牙齿用含高浓度双抗的PBS液充分清洗，以去除口腔中的细菌。取出的牙髓组织也经过同样处理以减少组织来源的污染机会。同时使用低内毒以及低血红蛋白含量的优质血清，明显增加了组织志周围细胞生长的速度。
本试验研究表明，乳牙牙髓基质细胞具有极强的增值活力，可以在短期内获得组织工程需要的细胞量，而且脱落乳牙的牙髓属于废用组织，相对于恒牙牙髓取材简便、增值活力强、便于实现自体移植，临床应用前景优于恒牙牙髓组织，为牙再生的研究提供了新的种子细胞来源[4，5]。
本试验已经初步解决了乳牙牙髓细胞的原代培养、鉴定和矿化诱导的条件，但是对于诱导液的成分、诱导时间、细胞分化机制以及诱导后细胞在三维支架上形成本质样结构等方面还需要进一步的研究。
参考文献：
[1] Murray PE，Garcia-Godoy F. et al. Stem cell responses in tooth regeneration. Stem Cells Dev. 2004 Jun；13（3）：255-62.
[2] Thesleff I. Developmental biology and building a tooth. Quintessence Int. 2003 Sep；34（8）：613-20.
[3] Miura M， Gronthos S， Zhao M， et al. SHED：stem eclls from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 May 13；100（10）：5807-12. Epub 2003 Apr 25.
[4] Thesleff I， Tummers M. Stem cells and tissue engineering： prospects for regenerating tissues in dental practice. Med Prine pract. 2003；12 Suppl 1：43-50
[5] 林云锋，田卫东，陈希哲.成体干细胞及其在颌面外科应用的研究进展；国外医学口腔医学分册2003，30（4），275～276.
