【摘要】目的 探讨大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法 体外培养的K562细胞，用不同浓度大蒜素处理24、48、72h，MTT法测定其对K562细胞增殖的影响；大蒜素（浓度分别为3、6、12μg/mL）处理K562细胞48h后，分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、Rh123探针染色流式细胞仪检测线粒体膜电位变化、分光光度计检测Casepase-3、Casepase-9相对活性、western blot法检测环氧合酶2（COX-2）表达情况。结果 大蒜素（浓度2~32 μg/mL）能抑制K562细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；大蒜素（浓度分别为3、6、12 μg/mL）作用K562细胞48 h后，细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%，对照组凋亡率为2.2%；Casepase-3、Casepase-9相对活性显著增加；COX-2的表达降低，呈剂量依赖性。结论 大蒜素能抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与下调COX-2基因的表达、增加细胞Casepase-3、Casepase-9活性及降低线粒体膜电位有关。大蒜素是一种前景广阔的抗肿瘤药物。
【关键词】大蒜素；K562细胞；Caspase-3；Caspase-9；环氧合酶-2
【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0141-01
大蒜素（Allicin）是大蒜中最重要的有效成分，其具有广泛的生物学作用，包括抗菌、抗炎、抗血栓、降血压、降血脂、降血糖、调节免疫力等。流行病学表明，大蒜素的摄入能减少多种肿瘤的发生［1］；动物和细胞实验研究证实，大蒜素在体内外对多种肿瘤包括皮肤癌、肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等均有抗肿瘤作用［2］。为探讨大蒜素对血液系统肿瘤的的影响及其机制，本研究以人白血病细胞系K562细胞为对象，观察大蒜素对人白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡的影响，并检测大蒜素对K562细胞线粒体膜电位、Caspase-3、Caspase-9活性变化及western blot检测环氧合酶-2（COX-2）蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 人白血病细胞系K562细胞购自中国科学院上海细胞库；大蒜素注射液购于山西普德药业股份有限公司（30 mg/支）；MTT、罗丹明123（Rhodamine 123, Rh123）购于sigma公司；IMDM培养液、胎牛血清系GIBCO产品；AnnexinV /PI试剂盒、Caspase-3、Caspase-9活性检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；COX-2单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根酶标记鼠抗山羊IgG购自武汉博士德生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 K562细胞培养于IMDM培养液中（10％小牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素），置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养箱内培养，根据生长情况3~5 d传代一次。
1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的K562细胞，以1×104/ml的浓度、每孔200 μl接种于96孔板，待细胞贴壁后分为实验组和对照组，实验组分别加入大蒜素终浓度为2、4、8、16、32 μg/mL的培养液，对照组加入等量的培养液，并设立调零孔。每组设5个复孔，分别培养24、48、72 h，实验结束前4 h每孔加入加入20 μl MTT试剂，培养箱中继续孵育4 h，然后小心吸掉上清，每孔加150 μl DMSO，摇床上振荡10min使结晶充分溶解，酶标仪检测570 nm处的吸光值（A值），抑制率=［1-(实验组平均A值-调零孔A值)/(对照组平均A值-调零孔A值)］×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，以1×106/ml浓度接种于6孔培养板中，贴壁后分为实验组和对照组，实验组分别加入大蒜素终浓度分别为3、6、12 μg/mL的培养液，对照组加入等量培养液，培养48 h后，收集细胞，离洗固定后加入AnnexinV-FITC 和PI染色。筛网过滤送流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.4分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9活性变化 细胞接种及分组同上，培养48 h后，收集细胞，分别加入50 μl冷裂解缓冲液，冰浴裂解15 min，然后4 ℃，1200r/min离心15 min，将上清移至预冷的离心管中，置于冰上，取5 μl用BCA法测定蛋白浓度，取50 μl调好蛋白浓度（2~4 g/L），加入20 μl反应缓冲液吹打均匀，加入5 μl Caspase-3、Caspase-9反应底物Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA，细胞培养箱中避光孵育4 h，酶标仪上405 nm处测定吸光度（OD405）。
1.2.5 Rh123染色流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位水平 细胞接种及分组同上，收集细胞，PBS漂洗3次，重悬于1 ml的1μg/ml Rh123中，放置培养箱中孵育30 min。PBS洗涤3次，用EPICS-XL型流式细胞仪以507 nm为激发波长，529 nm为发射波长测定细胞内荧光强度。
1.2.6 western blot检测COX-2蛋白表达变化 细胞接种及分组同上，收集细胞，用PBS漂洗，参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，蛋白样品加入1/5体积的5×上样缓冲液，沸水煮沸5min后离心，以每孔20 μg/孔上样，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转至PVDF膜上，用 5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入1:1000稀释的鼠抗人COX-2蛋白，4℃过夜，β-actin作为内参，TBST洗膜3次，加入1:1000稀释的辣根酶标记的兔抗山羊IgG，室温孵育2h，同样洗膜3次，ECL显色，观察各条带深浅变化。
1.2.7 统计学分析 所有资料经SPSS17.0医学统计软件处理，计量资料以（X±s）表示，两样本间参数比较采用独立样本t检验，以P < 0. 05 为差异具有显著性。
2 结果
2.1 大蒜素对K562细胞增殖的影响
MTT法检测显示，大蒜素能显著抑制K562细胞增殖，且随着大蒜素浓度的增加和作用时间的延长，其抑制作用逐渐增强，呈明显的浓度和时间依赖效应（表1）。
表1 大蒜素对K562细胞增殖的影响（X±s）
2.3 大蒜素对K562细胞凋亡的影响
大蒜素（浓度分别为3、6、12 μg/mL）处理K562细胞48 h后，流式细胞仪检测结果显示细胞凋亡率分别为11.5%、21.4%、36.6%，而对照组凋亡率仅为2.2%，表明大蒜素能诱导K562细胞凋亡（图1）。
2.4大蒜素对细胞线粒体膜电位的影响
Rh123染色流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位结果显示，不同浓度大蒜素处理48 h后，K562细胞线粒体荧光强度随着药物浓度的升高逐渐降低（P<0.05）（图2），而Rh123荧光强度值可反映线粒体膜电位（MMP）相对强度。表明大蒜素能降低K562细胞线粒体膜电位的作用。
2.5大蒜素对K562细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响
Caspase-3、Caspase-9活性检测示3、6、12 μg/mL大蒜素作用K562细胞48 h后，Caspase-3相对活性明显升高，分别为0.194±0.02、0.253±0.04和0.316±0.03，与对照组（0.113±0.02）比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；Caspase-9活性亦明显升高，分别为0.177±0.02、0.234±0.03和0.305±0.04，与对照组（0.105±0.02）比较，差异具有统计学意义（P<0.05），表明大蒜素能升高K562细胞Caspase-3、Caspase-9活性（图3）。
2.6大蒜素对K562细胞COX-2蛋白表达的影响
大蒜素作用K562细胞48 h后，结果显示随着大蒜素浓度的升高，COX-2蛋白表达量逐渐降低，结果见图4。
3 讨论
细胞凋亡是多细胞机体维持内环境稳定的自我调节机制，细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡在肿瘤发生发展中起重要作用［3］，细胞凋亡是程序化、多基因调控的细胞死亡过程，通过诱导细胞凋亡已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究发现，大蒜素在2~32 μg/mL浓度范围均能抑制K562细胞的增殖，且随着药物浓度的升高和作用时间的延长，其抑制作用亦逐步增强，呈明显的浓度效应及时间效应。流式细胞仪检测显示，大蒜素处理后，K562细胞出现明显的凋亡，且细胞凋亡率随药物浓度的升高而增加，呈明显的浓度依赖效应。表明大蒜素可抑制K562细胞的增殖及诱导其发生凋亡。
在细胞凋亡的机制研究中，线粒体在各种凋亡过程中起着重要的调节作用。正常细胞中线粒体膜电位维持在一定水平，当线粒体膜电位耗散时，线粒体呼吸链受损，ATP合成受抑制，线粒体释放细胞色素C等线粒体蛋白，通过信号转导，激活caspase级联反应和其他凋亡相关蛋白，伴随ROS水平升高，使DNA断裂，并产生凋亡小体，导致细胞凋亡。本研究发现，不同浓度大蒜素处理48 h后，K562细胞内线粒体荧光强度随着药物浓度的升高逐渐降低，即线粒体膜电位（MMP）相对强度降低，且线粒体膜电位降低趋势与细胞凋亡率增加趋势一致，表明大蒜素可能通过下降线粒体膜电位触发细胞凋亡的发生。
Caspase家族的激活在细胞凋亡过程中起着关键作用，被认为是引起凋亡的直接效应物。Caspase-9是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶，处于Caspase“瀑布式”激活的顶端，它的活化对线粒体凋亡通路尤为重要，并进一步激活Caspase-3，Caspase-3活化后可裂解DNA修复相关分子、凋亡抑制蛋白、细胞外基质蛋白和骨架蛋白等，促进细胞凋亡。Caspase-3是凋亡过程的主要效应分子，其活化标志着凋亡进入不可逆阶段。本研究发现，大蒜素作用K562细胞48 h后，细胞Caspase-3、Caspase-9活性明显升高，并呈明显浓度依赖效应，提示大蒜素可能通过激活Caspase-3、Caspase-9级联的线粒体依赖性途径诱导K562细胞凋亡。
COX-2是前列腺素（prostaglandins, PG）特别是前列腺素E2（PGE2）合成过程的重要限速酶，研究发现，COX-2在肿瘤包括结直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌及头颈部肿瘤等肿瘤中过表达。COX-2能通过促进细胞恶性转化、抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管新生、抑制抗肿瘤免疫等机制参与多种肿瘤发生、血管生成、侵袭转移等［4］，因此，COX-2被认为是抗肿瘤的一个靶点。本研究发现，大蒜素能下调COX-2表达，提示这可能是大蒜素的作用机制之一。
综述所述，本研究发现大蒜素可抑制K562细胞增殖，并诱导其发生细胞凋亡，其机制可能与下调COX-2表达，并增加细胞Caspase-3、Caspase-9活性，并降低线粒体膜电位，激活Caspase级联反应，导致细胞凋亡。肿瘤的凋亡是一个复杂而又精确调控的网络系统，大蒜素诱导凋亡的相关信号通道，是我们下一步要进行的工作。
图1流式细胞仪检测大蒜素对K562细胞凋亡率的影响
(a)control; (b)3 μg/mL; (c) 6 μg/mL; (d) 12 μg/mL
图2大蒜素对K562细胞线粒体膜电位的影响（#P<0.05）
图3大蒜素对K562细胞Caspase-3、Caspase-9相对活性的影响
图3大蒜素对K562细胞COX-2表达的影响
参考文献
［1］Milner JA. A historical perspective on garlic and cancer ［J］. J Nutr, 2001, 131(3s): 1027S-1031S
［2］Zha S, Nelson W G, et al. Cyclooxygenases in cancer: progress and perspective ［J］. Cancer Lett, 2004, 215(1): 1-20
［3］Wang D, Dubois RN. Eicosanoids and cancer ［J］. Nat. Rev. Cancer, 2010, 3,181–193.
［4］李杰，杨红，郝洪岭. 环氧合酶-2与肿瘤研究进展［J］. 临床误诊误治，2012, 25(4): 73-75
