[摘要] 目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。
[关键词] 金黄色葡萄球菌;中毒休克综合征毒素-1基因;杀白细胞毒素基因
[中图分类号]R37 [文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)1(b)-070-02
Development of multiplex PCR for the detection of antibiotic-resistant gene and pathogenic genes in staphylococcus aureus
WANG Fengling, LIU Guohua, HOU Yingrong
(Laboratory Department of Cangzhou Traditional Chinese Medicine and Western Hospital, Hebei Province, Cangzhou 061001, China)
[Abstract] Objective: To study the features of staphylococcal toxic shock syndrome toxin (TSST-1), PVL and antibiotic resistant gene carried by staphylococcus aureus. Methods: The detection of PVL gene, mecA gene and TSST-1 gene were carried out by multiplex PCR. Results: 84 strains of staphylococcus aureus were detected mecA gene with multiplex PCR, and the detection rate was 58.3% (49/84). The isolation rate of PVL-positive strain was 23.8% (20/84) in S. aureus isolates. MRSA of PVL-positive had 13 strains (13/49, 26.5%), MSSA of PVL-positive had 7 strains (7/35, 20.0%), they showed no statistical difference(P>0.05). The prevalence of TSST-1 gene was not detected. Conclusion: The antibiotic resistance of staphylococcus aureus is increasing. Staphylococcus aureus may secrete various toxins. We should pay attention to detecting these toxins when separating staphylococcus aureus.
[Key words] Staphylococcus aureus; Toxic shock syndrome toxin-1 gene; Panton-valentine leukocidin gene
感染性疾病是全球最常见的疾病,金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是引起化脓性感染的主要病原菌。随着抗菌药物的广泛应用,金葡菌的耐药性逐渐增加,其中耐甲氧西林金葡萄菌(MRSA)的检出尤为明显。MRSA的耐药机制主要是它获得了含有mecA耐药基因的可移动遗传元件,即SCCmec盒。金葡菌能产生和分泌多种毒素[如杀白细胞毒素(PVL)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素及表皮剥脱性毒素等],这些毒素已被证明与食物中毒、中毒性休克、皮肤烫伤样综合征及作为超抗原功能有关[1]。因此,非常有必要对金葡菌进行耐药基因及致病毒素基因的检测,防止此类细菌的播散。我科对我院临床分离的金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因PVL基因和TSST-1基因进行检测,并对其所引起的感染进行分析。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
84株金葡菌均为我科2008年1月～2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司WalkAway-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。
1.2 细菌鉴定质控菌株
金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。
1.3 仪器与试剂
WalkAway-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。
1.4 引物设计
根据GenBank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mecA基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。
mecA:P1 5"-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3",P2 5"-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3"。
PVL:P1 5"-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3",P2 5",-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3"。
TSST-1:P1 5"-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3",P2 5"-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3"。
1.5 细菌DNA的提取
将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100 μl裂解液(1 mol/L NaOH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400 μl无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200 μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30 μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。
1.6 多重PCR扩增体系及反应条件
把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20 μl反应体系,模板1 μl,起始引物和终末引物各1 μl,dNTP 1.5 μl,Taq酶0.2 μl,10× Buffer 2 μl,Mg2+ 2 μl,双蒸水11.3 μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。
1.7 序列测定
将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析
84株金葡菌中检出mecA基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。
图1 PVL阳性菌株电泳结果
(1～6、9～11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)
2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点
PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。
2.3 测序结果的分析
将测序结果与GenBank中的已有序列进行比较,同源性为100%。
3 讨论
最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mecA)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mecA基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。
PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。
TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。
[参考文献]
[1]Becker K, Friedrich AW, Lubritz G, et al. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J]. J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.
[2]Yamasaki O, Kaneko J, Morizane S, et al. The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection [J]. Clin Infect Dis,2005,40(3):381-385.
[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.
[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.
[5]Lopez-Aguilar C, Perez-Roth E, Moreno A, et al. Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylococcal disease [J]. J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.
[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.
[7]Nakagawa S, Kushiya K, Taneike I, et al. Specific inhibitory action of anisodamine against a staphylococcal superantigenic toxic, toxic shock syndrome toxin 1(TSST-1), leading to down-regulation of cytokine production and blocking of TSST-1 toxicity in mice [J].Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(3):399-408.
(收稿日期:2009-07-13)
