摘要：目的观察艾烟可吸入颗粒物(PM10)对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响,并探讨其诱导凋亡的可能机制。方法采用体外实验方法,以A549细胞为研究对象,采用Hoechest33258染色法,荧光显微镜观察艾烟PM10对A549细胞凋亡的影响,检测细胞内Ca2+水平、核因子(NF)-κB p65表达量及细胞内活性氧(ROS)的水平。结果艾烟PM10处理4 h在400 μg/mL时出现部分凋亡细胞。艾烟PM10干预A549细胞4 h后,随着浓度增加,细胞内Ca2+水平显著增加(P＜0.01)。与空白对照组比较,艾烟干预4 h,各浓度组A549细胞内NF-κB p65表达量均降低(P＜0.05)；干预20 h,70 μg/mL组和280 μg/mL组NF-κB p65表达量均降低(P＜0.05),140 μg/mL组NF-κB p65含量无明显变化(P＞0.05)。相同浓度下,不同时点艾烟干预各组间比较,NF-κB p65表达量无明显变化(P＞0.05)。与空白对照组比较,艾烟PM10处理各组细胞内ROS水平均显著降低(P＜0.05)。结论艾烟PM10能诱导A549细胞凋亡、提高A549细胞内Ca2+水平。
关键词：艾灸；艾烟PM10；A549细胞；细胞凋亡；钙离子；核因子-κB p65
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.07.016
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1005-5304(2014)07-0053-05
Effect of PM10 in Moxa Smoke on Apoptosis of Human Lung Adenocarcinoma Cell Line-A549 CellsHUANG Yu-hai1, LIU Ping1,2, YANG Bi-cheng3, CUI Ying-xue1, HUANG Chang1, LIU Jun-tian1, ZHAO Bai-xiao1 (1.School of Acupuncture and Moxibustion of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China；2.Beijing Electric Power Hospital of North China Grid Company Limited, Beijing 100073, China；3.Jiangxi Maternal and Child Health Hospital, Nanchang 330006, China)
Abstract：Objective To observe the effect of PM10 (inhalable particles) in moxa smoke on apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line-A549 cells, and explore the possible mechanisms of inducing apoptosis Methods The A549 cells were studied in vitro experiment method, which were stained by Hoechest33258 staining method. Their morphological changes of apoptosis were observed by the fluorescence microscopy. The levels of intracellular Ca2+ and reactive oxygen species (ROS), and expression of NF-κB p65 were also measured. Results Some apoptotic cells were observed after treated with moxa smoke PM10 in the concerntration of 400 μg/mL. After 4 hours intervention by moxa smoke PM10 in A549 cells, the intracellular Ca2+ level increased significantly (P＜0.01). Compared with the blank control group, the expression of NF-κB p65 decreased significantly (P＜0.05) after intervention of moxa smoke PM10 with different concerntrations for 4 hours. When the A549 cells were cultured with moxa smoke PM10 for 20 hours, the expression of p65 decreased significantly (P＜0.05) in the concerntrations of 70, 280 μg/mL, while there was no significant change in the concerntration of 140 μg/mL (P＞0.05). Compared with the blank control group, ROS level was significantly lower (P＜0.05) in A549 cells after intervention of moxa smoke PM10. Conclusion PM10 in moxa smoke could induce apoptosis of A549 cells, could increase cytosolic Ca2+ level.
Key words：moxibustion；PM10 in moxa smoke；A549 cells；apoptosis；Ca2+；NF-κB p65
基金项目：国家重点基础研究发展计划(2009CB522906)；北京中医药大学自主课题(2011-JYBZZ-XS100)
通讯作者：赵百孝,E-mail：baixiao100@vip.sina.com
艾烟是中医艾灸疗法中艾绒燃烧时产生的烟雾,现代研究表明,艾烟有抗癌、抗菌、抗病毒、平喘等功效,对呼吸系统、心血管系统、消化系统、免疫系统等均有较强的生物学作用[1],同时艾烟中含有大量的可吸入颗粒(PM10),可直接进入呼吸道。近年来,有文献报道大气中的PM10具有强氧化性,会对机体,尤其是呼吸系统造成伤害,甚至诱发肺癌[2]。本实验采用Hoechest33258染色法,荧光显微镜观察艾烟PM10对A549细胞凋亡的影响,探讨其诱导凋亡的可能机制。
1实验材料
1.1细胞
人肺腺癌A549细胞,中国人民解放军军事医学科学院放射与辖射研究所提供。
1.2艾条
3年蕲艾条,南阳汉医艾绒有限责任公司生产。
1.3主要试剂与仪器
高糖DMEM培养基粉剂,美国Gibco公司；胰蛋白酶(Trypsin)、二甲基亚砜(DMSO),美国Sigma公司；胎牛血清(FBS),美国Hychone公司；TransAMTM核因子(NF)-κB p65试剂盒,美国Active Motif公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Hoechest33258染料、苯甲基磺酰氟(PMSF),上海碧云天生物技术公司；碘化丙啶(PI)染料,美国Sigma公司；Ca2+探针、活性氧(ROS)探针(DCFH-DA粉剂),美国Sigma公司；荧光显微镜,日本Olympus公司；酶标仪,美国Bio-Rad公司；Thermo Scientific Multiskan GO全波长读数仪/超微量分光光度计,美国Thermo Scientific公司；Mini VolTM PM10便携式空气采样器：美国Mini Vol公司；6孔培养板、60 mm培养皿,美国Corning公司；Whatman剑桥滤片(直径44 mm)；英国沃特曼(Whatman)公司,不透明96孔白板Cliniplate,美国Thermo公司；自制艾烟PM10采样玻璃箱。
2实验方法
2.1主要溶液的制备
2.1.1艾烟PM10原溶液撕下包裹艾条的棉纸,将其中的艾绒置于玻璃箱中点燃,将Mini VolTM PM10便携式采样器放入玻璃箱中,用剑桥滤片进行采样,流量5 L/min。采样前后剑桥滤片的质量差即为艾烟PM10的质量。用适量DMSO溶解剑桥滤片上的PM10,制成终浓度为40 mg/mL的艾烟PM10原溶液,0.22 μm滤器过滤除菌,避光存储于-80 ℃备用。每次实验前用培养液稀释至所需浓度(DMSO浓度≤1%)。
2.1.2活性氧探针溶液将3.5 mg DCFH-DA粉剂溶解于721 μL乙醇中(浓度为10.0 mmol/L),之后用PBS稀释上述溶液10倍,配置成1.0 mmol/L的储存液。
2.2细胞凋亡形态观察
常规消化对数期生长的A549细胞,将细胞接种于60 mm细胞培养皿中,置37 ℃、5%C02细胞培养箱中培养。24 h后加入含艾烟PM10的DMEM培养液,设160、320、400 μg/mL 3个浓度组及空白组,每个培养皿内液体的终体积均为12 mL,每个浓度设3个平行样。置于37 ℃、5%C02孵箱中继续培养4 h后,用PBS轻轻洗涤贴壁细胞,加入Hoechest 33258(5 μg/mL,溶解于培养液中),37 ℃孵育15 min后再用PBS轻轻冲洗细胞2次,加入PI染料(5 μg/mL)孵育2 min,再用PBS轻轻冲洗以上细胞,待皿中液体晾干后,通过荧光显微镜观察细胞凋亡形态。正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的区分标准为：正常细胞核规则,呈暗蓝色,细胞完整；凋亡细胞细胞核为亮蓝色,呈浓缩状并断裂；坏死细胞细胞核为红色,呈放大型,细胞结构不完整。
2.3A549细胞内钙离子水平测定
常规消化对数期生长的A549细胞,将其接种96孔板(约1×lO4/孔),置37 ℃、5%C02细胞培养箱中培养。24 h后加入含艾烟PM10的DMEM培养液,设160、320、400 μg/mL 3个浓度组及空白组,每个培养皿内液体的终体积均为200 μL,每个浓度设3个平行样。置于37 ℃、5%C02孵箱中继续培养4 h后,用PBS轻轻洗涤贴壁细胞,加入浓度为1 μmol/L的Ca2+探针,37 ℃、5%CO2培养箱中静置30 min取出细胞,用无菌PBS小心洗涤细胞3次后,上荧光发光检测仪,选择波长为490 nm激发波长和514 nm发射波长检测各组细胞的荧光强度。每组实验重复3次。
2.4A549细胞内核因子-κB p65蛋白测定
常规消化对数期生长的A549细胞,将细胞接种于60 mm细胞培养皿中,置37 ℃、5%C02细胞培养箱中培养。24 h后加入含艾烟PM10的DMEM培养液,设70、140、280 μg/mL 3个浓度组以及空白组,每个培养皿内液体的终体积均为12 mL。置于37 ℃、5%C02孵箱中继续培养4、20 h后,用PBS清洗细胞2次,用细胞刷将各组细胞刮下。按ELISA试剂盒说明书要求操作。选择655 nm波长用分光光度计测各孔的OD值。OD值的强弱与蛋白浓度呈正比。
2.5A549细胞内活性氧测定
将常规消化对数期生长的A549细胞接种96孔板
(约1×lO4/孔),置于37 ℃、5%C02细胞培养箱中培养。24 h后加入含艾烟PM10的DMEM培养液,设160、320、400 μg/mL 3个浓度组以及空白组,每孔终体积均为200 μL,每个浓度设3个平行样。置于37 ℃、5%C02孵箱中继续培养4 h后,小心吸掉含艾烟PM10的培养液,加入无菌PBS溶液轻轻摇荡,洗涤细胞2次,加入浓度为10 μmol/L的ROS探针DCFH-DA, 37 ℃、5%CO2培养箱中静置30 min,从孵育箱中取出细胞,用无菌PBS小心洗涤细胞3次后,上荧光发光检测仪,选择波长为485 nm激发波长和540 nm发射波长检测各组细胞的荧光强度。实验重复3次。
3统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。各浓度组数据若服从正态分布,组间比较采用方差分析；若不服从正态分布,采用非参数检验,结果用中位数和四分位数间距[M(q1-q3)]表示。P＜0.05表示差异有统计学意义。
4结果
4.1艾烟PM10对A549细胞凋亡的影响
采用Hoechst33258和PI染色,荧光显微镜观察A549细胞形态。艾烟PM10处理4 h后,160 μg/mL时部分细胞核内染色体有轻微固缩,320 μg/mL时可见大量细胞染色体明显固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布,400 μg/mL时出现部分凋亡细胞,细胞核呈亮蓝色。结果见图1。
注：A.空白组；B.160 μg/mL组；C.320 μg/mL组；D.400 μg/mL组
图1各组A549细胞凋亡形态比较(PI染色,×200)
4.2艾烟PM10对A549细胞内钙离子水平的影响
用不同浓度艾烟PM10干预A549细胞4 h后检查细胞质内Ca2+水平,结果显示,随着艾烟浓度的增加,细胞内Ca2+水平显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01)。结果见图2。
注：与空白组比较,**P＜0.01
图2各组A549细胞内Ca2+水平比较
4.3艾烟PM10对A549细胞内核因子-κB p65表达的影响
与空白组比较,艾烟干预4 h,艾烟干预各组A549细胞内NF-κB p65表达量均降低,差异有统计学意义(P＜0.05)；干预20 h,70 μg/mL组和280 μg/mL组NF-κB p65表达量降低,差异有统计学意义(P＜0.05),140 μg/mL组NF-κB p65含量无明显变化。4 h艾烟干预各组NF-κB p65表达量组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；干预20 h,与70 μg/mL组比较,140 μg/mL组NF-κB p65显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05)；280 μg/mL组NF-κB p65显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)；与140 μg/mL组比较,280 μg/mL组内NF-κB p65显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。相同浓度艾烟干预不同时间各组比较,NF-κB p65表达量无明显变化(P＞0.05)。结果见表1。
表1各组A549细胞内NF-κB p65表达比较[M(q1-q3)]
组别4 h20 h
空白组0.15(0.12-0.18)0.11(0.10-0.12)
70 μg/mL组0.08(0.06-0.09)*0.09(0.09-0.10)*
140 μg/mL组0.08(0.06-0.08)*0.10(0.10-0.13)▲
280 μg/mL组0.07(0.06-0.07)*0.06(0.05-0.07)*▲△
注：与空白组比较,*P＜0.05；与70 μg/mL组比较,▲P＜0.05；
与140 μg/mL组比较,△P＜0.05
4.4艾烟PM10对A549细胞内活性氧水平的影响
与空白组比较,艾烟PM10处理4 h各组细胞内ROS水平均显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01)。艾烟PM10处理各组组间比较,400 μg/mL组细胞内ROS水平最低,与其余2组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；160 μg/mL组和320 μg/mL组比较,细胞内ROS水平无显著差异(P＞0.05)。结果见图3。
注：与空白组比较,**P＜0.01；与160、320 μg/mL组比较,▲▲P＜0.01
图3各组A549细胞内ROS水平比较
5讨论
细胞凋亡形态学实验表明,艾烟PM10具有诱导A549细胞凋亡的作用,细胞死亡可以分成坏死和凋亡。坏死是细胞被动死亡的过程,而凋亡是细胞在细胞外或细胞内信号诱导下发生的自主选择性死亡,需要启动细胞内特殊的死亡程序。细胞凋亡过多会使许多组织过早退化,凋亡过少则会出现异常的增殖,导致疾病的发生。实验结果表明,艾烟PM10干预4 h后A549细胞在160 μg/mL时细胞核内染色体开始固缩,320 μg/mL时染色体固缩明显,400 μg/mL时出现了明显的亮蓝色凋亡细胞。这说明随着艾烟PM10浓度的增加,凋亡细胞逐渐增多。这与细胞周期流式图中结果一致[8],提示艾烟PM10具有诱导A549细胞凋亡的作用。
细胞凋亡的相关转导途径大致可分为两类：内源性途径和外源性途径。在不同的细胞凋亡因素刺激下,不同凋亡途径被激活。其中,内源性途径是细胞凋亡的主要途径,主要通过线粒体进行调节,所以也称为线粒体介导的凋亡途径。各种刺激因素引起线粒体膜电位改变,导致其通透性的改变,是该途径诱导凋亡发生的关键步骤。膜电位的改变与细胞质内Ca2+的浓度有关。当线粒体内Ca2+流入细胞质或各种因素导致内质网内的Ca2+大量进入细胞质时,均会使线粒体膜电位降低[5]。这导致其通透性增高,释放出大量cytC,并与Apaf-1形成Apaf-1-cytC多聚复合体。NF-κB是一种分布和作用均十分广泛的真核细胞转录因子,它对机体许多生物过程如免疫反应、细胞存活和生长都起着重要作用,也与许多疾病的发生有着密切关系[6]。在哺乳动物体内,已经发现的NF-κB共有5种,分别是RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50/p105 (NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)。通常所说的NF-κB蛋白是指p50/p65异源性二聚体。目前的研究表明,NF-κB主要通过以下途径来抑制凋亡：①通过调控细胞因子而参与自身细胞的凋亡；②通过诱导或上调抗凋亡基因,如Bcl-x、TRAF1、TRAF2等抑制凋亡；③通过诱导TRAF(肿瘤坏死因子受体相关因子)和凋亡抑制蛋白而抑制凋亡[7]。
本实验观察了艾烟PM10作用于A549细胞4 h后,细胞内Ca2+水平结果显示,随着艾烟PM10浓度的增加,细胞内Ca2+水平显著上升,呈明显的剂量依赖性,NF-κB p65含量随着浓度增加而明显降低,但与时间的关系不明显。故艾烟可使细胞内Ca2+水平增加又能抑制NF-κB p65表达,进而激活线粒体凋亡途径,从而引诱导A549细胞凋亡。
ROS是一组具有强氧化作用的分子,包括超氧化物(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟氧自由基(传H)和单态氧(1O2)。内源性ROS是细胞内多种信号转导通路的信号分子,在维持信号通路的强度和持续性上发挥重要作用。有报道,ROS参与了与细胞增殖、凋亡等相关的信号转导,且具有双重调节作用[8]。
ROS是一个在生理和病理条件下对机体起着重要作用的细胞内调节信号分子。机体内ROS水平过高,会对细胞、蛋白以及DNA等造成氧化损伤,促进肿瘤形成和正常细胞的死亡。有研究表明,由于肿瘤细胞新陈代谢特别旺盛,细胞内ROS水平显著高于正常组织细胞[9],癌细胞自身的高氧化应激状态会使其对大量增加的ROS更加敏感。大黄中的有效成分如大黄素、芦荟大黄素以及大黄酸无论在细胞实验还是动物实验中都体现出了抗癌作用,这与它们能产生ROS,诱导癌细胞走向凋亡有关[10]。此外,降低肿瘤细胞内的ROS水平也能诱导其凋亡。黄芩素是黄芩中的有效成分,是黄酮类化合物,被证明具有抗氧化作用[11]。Baumann等[12]的研究结果表明,黄芩素可通过抗氧化作用,将恶性T淋巴细胞中过多的传2-自由基还原成H2O2,而一过性增高的H2O2可选择性地激活PLCγ1蛋白,从而使内质网中的Ca2+大量流入细胞质,引起线粒体膜电位的降低,进而诱导恶性T淋巴细胞的凋亡。
本研究显示,艾烟PM10随着剂量升高能显著降低A549细胞内ROS水平,即随着浓度增高,艾烟PM10抗氧化作用增强。实验结果又显示,随着剂量升高,细胞内Ca2+水平也增高。我们认为在艾烟PM10作用于A549细胞时,有可能产生类似上述黄芩素对恶性T淋巴细胞的作用,使传2-自由基还原成H2O2,一过性增高的H2O2选择性地激活PLCγ1蛋白,从而使内质网中的Ca2+大量流入细胞质,进而诱导A549凋亡。艾烟PM10抗氧化作用和Ca2+水平及细胞凋亡之间的关系仍需进一步研究。
综上,艾烟PM10能诱导A549细胞凋亡,这可能与其可使细胞内Ca2+水平增加又能抑制NF-κB p65表达,进而激活线粒体凋亡途径有关；艾烟PM10可提高A549细胞内Ca2+水平,可能与其抗氧化作用有关。
参考文献：
[1] 周次利,吴焕淦,马晓芃,等.艾化学成分生物学作用及安全性探讨[C]//中国针灸学会2009学术年会论文集,北京：2009.
[2] 周林,邵龙义,宋晓焱,等.宣威肺癌高发区室内PM10的生物活性研究[J].毒理学杂志,2009,23(6)：439-441.
[3] Sarath VJ, So CS, Won YD, et al. Artemisia princeps var orientalis induces apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells[J]. Anticancer Research,2008,27(6B)：3891-3898.
[4] Sakagami H, Matsumoto H, Satoh K, et al. Cytotoxicity and radical modulating activity of moxa smoke[J]. In Vivo,2005,19(2)：391-397.
[5] Zhou P, Chou J, Olea RS, et al. Solution structure of Apaf-1 CARD and its interaction with caspase-9 CARD：a structural basis for specific adaptor/caspase interaction[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999,96(20)：11265-11270.
[6] Karin M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression[J]. Nature,2006,441(792)：431-436.
[7] 刘小雨,沈自尹,黄建华,等.淫羊藿总黄酮经由核因子-kB相关信号转导途径调控免疫衰老机制[J].中国中西医结合杂志,2006,26(7)：620-624.
[8] 刘平.艾烟可吸入颗粒物对人肺腺癌A549细胞增殖及基因表达谱的影响[D].北京：北京中医药大学,2013.
[9] Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Targeting Cancer cells by ROS-mediated mechanisms：a radical therapeutic approach?[J]. Nature Reviews Drug Discovery,2009,8(7)：579-591.
[10] Huang Q, Lu G, Shen HM, et al. Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb[J]. Medicinal Research Reviews, 2007,27(5)：609-630.
[11] Gao Z, Huang K, Yang X, et al. Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects,1999,1472(3)：643-650.
[12] Baumann S, Fas SC, Giaisi M, et al. Wogonin preferentially kills m alignant lymphocytes and suppresses T-cell tumor growth by inducing PLCγ1-and Ca2+ dependent apoptosis[J]. Blood,2008, 111(4)：2354-2363.
(收稿日期：2013-11-22；编辑：华强)
