选择性激活巨噬细胞通过JAK2/STAT3途径促进胰腺癌SW1990细胞侵袭迁移

对照组（Control组）、SW1990细胞和Ua共培养组（Ua组）、SW1990细胞和M2共培养组（M2组）。采用Transwell共培养体系，将胰腺癌SW1990细胞与Ua、M2分别接种于相应小室，37℃共培养32 h后收集各处理组胰腺癌SW1990细胞。

1.4 qRT-PCR实验

细胞总RNA抽提方法参照RNAiso Plus试剂说明书操作，利用5×PrimeScript RT Master Mix试剂反转录合成cDNA，SYBRGreen法进行PCR扩增，以GAPDH基因作为内参。qPCR反应条件：95℃预变性3 min，然后95℃10 s，55℃30 s，总共40个热循环。结果采用△△Ct法进行分析。引物序列详见表1。独立重复实验3次，每次3个复孔。

1.5 Western blotting实验

用混合PMSF的RIPA细胞裂解液提取总蛋白并作蛋白定量，以每泳道50μg蛋白在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转膜，封闭液内室温孵育60min；用1：1000稀释的相应一抗4℃孵育过夜；室温用TBST洗膜3次，加入1：1 000稀释的相应辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次，用化学发光法进行显色，凝胶成像系统下成像。以各组JAK2、STAT3和GAPDH蛋白的灰度比值反映样品蛋白的相对表达水平，独立重复实验3次。

1.6划痕实验

在汇合度约100%的铺满单层SW1990细胞的Transwell下层小室内，用10μl移液枪尖端轻轻划痕，PBS洗去脱落细胞，在含1%胎牛血清的共培养体系中，在Transwell上层小室内相应加入Ua和M2（1×10⁶细胞/ml），和划痕后的SW1990细胞共培养，置于37℃、5%CO₂培养箱共培养，观察细胞的迁移情况并用倒置显微镜拍照，测量共培养前后划痕的宽度，实验结果通过Image J软件分析。独立实验重复3次。

1.7 Transwell侵袭实验

在Transwell上层小室底部膜的下表面包被10μl纤维连接蛋白，4℃放置48 h；把50μlMatrigel加入Transwell嵌套内，37℃孵育30 min。将生长状态良好的相应SWl990细胞用胰酶消化，进行细胞计数后用无血清的DMEM培养基清洗3次并用含0.1%BSA的无血清DMEM培养基重悬。在细胞小室的上层加入1×10⁵细胞/孔的胰腺癌SW1990细胞，体积补足至200μl。在下室接种不同激活状态的巨噬细胞，加入含10%FBS的DMEM培养基500μl。置于培养箱中37℃培养32 h后，取出小室，用棉签擦去小室膜上层的细胞，用5%多聚甲醛固定细胞10 min，用1%结晶紫染色20 min，置于显微镜下拍照，实验结果通过Image J软件分析。实验重复3次。

1.8统计学处理

采用SPSS 16.0版本软件进行统计学分析，实验数据使用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1不同激活状态巨噬细胞的形态

人外周血单个核细胞分离诱导实验第7天可获得光学显微镜下形态不同的巨噬细胞。Ua形态呈圆形为主；M1形态呈荷包蛋样扁圆形为主；M2形态呈显著梭形为主（图1）。

2.2选择性激活巨噬细胞促进胰腺癌SW1990细胞JAK2、STAT3的mRNA转录与蛋白表达

为研究JAK2和STAT3本身对胰腺癌SW1990细胞生物学行为的影响，分别将JAK2-siRNA和STAT3-siRNA小分子干扰片段转染胰腺癌SWl990细胞，转染48 h后收集相应的细胞。同时，收集单独培养组及与Ua、M2共培养32 h后的SWl990细胞。对5组处理的SW1990细胞进行qRT-PCR和Western blotting实验。结果表明，相比Control组，si JAK2组的mRNA与蛋白水平都显著下调（P<0.01）；图2C和图2D：Ua组与Control组的JAK2 mRNA和蛋白水平差异均无显著统计学意义（P>0.05）；相比Control组，M2组的JAK2 mRNA和蛋白水平均显著上调（P<0.01）；相比Ua组，M2组的JAK2 mRNA和蛋白水平也显著上调（P<0.01）；图2E和图2F：相比Control组，si STAT3组的mRNA与蛋白水平都明显下调（P<0.01）；图2G和图2H：Ua组与Control组的STAT3 mRNA和蛋白水平差异均无显著统计学意义（P>0.05）；相比Control组，M2组的STAT3mRNA和蛋白水平均显著上调，差异有统计学意义（P<0.01）；相比Ua组，M2组的STArl3 mRNA和蛋白水平也明显上调（P<0.01）。见图2。

2.3选择性激活巨噬细胞促进胰腺癌SW1990细胞的横向迁移

划痕实验结果显示，相比Control组，si JAK2组和si STAT3组的SW1990细胞迁移能力明显减弱（P<0.01）。相比Control组和Ua组，M2组SWl990细胞迁移能力明显增强（P<0.01），组间差异具有显著统计学意义。而Control组与ua共培养组SW1990细胞的迁移能力无明显差异（P>0.05）。见图3。

2.4选择性激活巨噬细胞促进胰腺癌SW1990细胞的纵向侵袭

Transwell侵袭实验结果表明，相比Control组，si JAK2组和si STAT3组SW1990细胞的侵袭能力明显减弱（P<0.01）；相比Control组和Ua组，M2组SW1990细胞的侵袭能力明显增强（P<0.01）。相比Control组，Ua共培养作用对SWl990细胞的侵袭能力无明显影响（图4）。

3讨论

TAMs作为肿瘤微环境的主要炎性一免疫细胞，研究表明其对胰腺癌的演进发挥重要影响，探究巨噬细胞与肿瘤细胞的相互联系，找到其促癌和抑癌功能的平衡点，对胰腺癌的诊治具有重要意义。胰腺组织缺乏完整的被膜，血供和淋巴组织丰富，肿瘤极易早期扩散，主要表现为直接浸润与淋巴转移，晚期则为腹膜种植和血行转移。研究表明，JAK/STAT信号通路是多种细胞因子在细胞内传递信号的共同途径，JAKs和STATs在多种人类恶性肿瘤组织和细胞系中存在高表达，而在正常组织中却很少表达或活化。

哺乳动物JAK蛋白家族是一类非受体型酪氨酸激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2 4个成员。JAKs的下游信号蛋白是STAT，哺乳动物的STAT家族可分为STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6七个亚型，其氨基酸序列与组织分布特异性取决于不同类型的细胞外信号。JAK2和STAT3作为JAK/STAT信号通路的重要成员，在多种人类疾病的发生发展中发挥关键作用。研究揭示，表皮生长因子可通过JAK2/STAT3通路调节E-钙黏素在结肠癌LoVo细胞中的表达和定位，增强结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。STAT3基因可能通过调节MMP-2、MMP-9的表达介导EMT从而促进浸润性乳腺癌的侵袭转移。JAK/STAT信号通路可与细胞间黏附分子及血管细胞黏附分子交互作用，进而影响前列腺癌干细胞的成球能力。

肿瘤的发生发展是细胞信号调节通路及其构成网络整体紊乱的结果，JAK2/STAT3信号通路的异常影响肿瘤细胞的增殖分化、侵袭转移、血管生成和免疫逃逸等生物学过程。本研究表明，分别单独转染si-JAK2和si-STAT3小分子干扰片段可明显抑制胰腺癌SWl990细胞的侵袭与迁移。相比对照组和ua共培养组，M2共培养作用可明显上调胰腺癌SWl990细胞JAK2、STAT3的mRNA与蛋白表达水平。M2可通过JAK2/STAT3信号通路显著促进胰腺癌SW1990细胞的侵袭与迁移能力，提示JAK2/STAT3信号通路或可成为胰腺癌新的研究靶位。诚然，深入研究JAK2/STAT3信号通路在胰腺癌侵袭和转移过程中的作用机制，结合TAMs生物学特性，针对JAK2/STAT3通路进行靶向干预，对胰腺癌临床诊治确有重要的理论意义和现实价值。

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