【摘要】:目的:研究p38MAPK及其信号通路在鼻息肉发病中的作用机制,以便更加深入的阐明鼻息肉的发病机制,为临床治疗鼻息肉及寻找特异性治疗药物提供理论依据。方法:选取20例未采用糖皮质激素治疗的复发性鼻息肉组织标本、20例初发鼻息肉组织标本、20例正常鼻黏膜组织。实验分为三组:A组:复发性鼻息肉组;B组:初发性鼻息肉组;C组:正常下鼻甲黏膜组,每组各20例。处理因素:体内为布地奈德;体外为布地奈德、克拉霉素和p38MAPK特异性抑制剂SB203580。按1997海口标准进行临床分期分型。上述标本部分于-70℃冻存备用,(1)采用HE染色和免疫组化染色对鼻息肉和正常鼻黏膜组织中的p38MAPK蛋白进行观测并拍照,并用JD109或JD801图像分析系统进行图像分析,测定阳性细胞数密度和灰度值。(2)按常规Western-blot实验操作步骤。结果判定:凝胶图像分析系统对比p38MAPK与GAPDH灰度比值。实验分体内和体外两个阶段。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:p38MAPK在正常下鼻甲黏膜组织中无或极少量表达,在鼻息肉组织中均显示高表达(P<0.01);复发型鼻息肉组织p38MAPK的阳性表达面积和密度均高于II型鼻息肉组(P<0.05)。结论:(1)p38MAPK在鼻息肉组织中高表达,而且在复发性鼻息肉组织中表达更显著。(2)结果表明p38MAPK信号通路参与鼻息肉的发生发展。
【关键词】:鼻息肉;p38MAPK;免疫组织化学
【中图分类号】R765.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-052-2
鼻息肉是一种常见病,发病率及复发率均较高,目前治疗最有效的方法为鼻内镜手术加糖皮质激素治疗,但是治疗后仍有20%左右复发,是鼻科目前治疗的难点。多种炎症因子的表达和EOS的作用是鼻息肉发生的重要环节[1]。
随着免疫学和分子生物学等学科的飞速发展,研究证明参与鼻息肉病理过程的化学介质多达数十种甚至上百种。其中细胞因子(cytokines)的作用倍受重视。细胞因子是由机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌,具有较强的生物活性,广泛存在于鼻息肉的微环境中。目前认为鼻息肉主要是由多种细胞因子参与的一种持续性炎症反应。p38MAPK信号通路是新近阐明的参与炎症机制的信号通路之一,可能在鼻息肉中起至关重要的介导TNF-α与COX-2的信号传导作用。
鼻息肉的发病机制中可能也存在经p38MAPK信号传导通路信号的干预和调控。目前相关文献中对p38MAPK信号传导通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究发现,p38MAPK在鼻息肉组织中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周围出现异常表达,且核内有磷酸化p38MAPK的表达[2,3]。
1材料和方法
1.1标本的选取标本选取近1年我院耳鼻喉科住院和门诊行鼻内镜手术的复发性鼻息肉患者20例,所有患者均有两次以上鼻息肉手术史,术前均未接受过糖皮质激素治疗;初次鼻息肉患者20例,未进行过鼻腔鼻窦手术,亦未接受过糖皮质激素治疗;行鼻腔泪囊吻合术或鼻中隔矫正术,取正常鼻黏膜组织20例。要求所有患者经检查无变应性鼻炎、支气管哮喘、慢性支气管炎、阿司匹林耐受不良和其他系统严重疾患。并按1997海口标准进行临床分期分型。研究前1个月内未进行激素和抗组胺药物治疗。经手术取出组织,术后均经病理证实。
1.2主要试剂(1)p38MAPK兔抗人多克隆抗体:购自美国Cayman公司,工作浓度1:250。(2)免疫组化二抗试剂盒SP-9001(生物素标记羊抗兔IgG):购自北京中杉金桥生物试剂公司。(3)DAB染色试剂盒:购自北京中杉金桥生物试剂公司。(4)多聚赖氨酸:购自武汉博士德公司。(5)牛血清白蛋白(BSA):SIGMA公司产品。
1.3方法(1)石蜡组织块制作:手术切除的鼻息肉和下鼻甲粘膜组织立即切成1.5×1.5×1.5mm3的组织块,并快速投入10%甲醛溶液固定液中,固定12小时。酒精脱水、二甲苯透明后浸蜡,包埋,待石蜡全部凝固后,推出蜡块。(2)石蜡切片:修整蜡块,调整控制切片厚度约5µm,切成薄片后,须粘在玻璃片上,以记号笔在玻片上编号,放入温箱中烘干。(3)免疫组织化学检测p38MAPK在鼻组织中的表达:将切片脱蜡入水。(4)抗原微波修复。(5)血清封闭抗原Fc段受体:取出玻片勿洗,直接加非免疫血清(二抗同族),置于湿盒中,4℃,过夜。滴加一抗:倾去血清,勿洗,滴加一抗p38MAPK(1:250)50μl。阳性对照采用一肝癌组织标本同样滴加一抗。阴性对照采用一鼻息肉石蜡切片,一抗用PBS替代。标本置于湿盒中,4℃,过夜。次日,用PBS洗3min,重复3次。加入辣根过氧化物酶标记二抗IgG,37℃,10～15min。用PBS洗3min,重复3次。加入辣根过氧化物酶标记试剂,37℃,10～15min,再用PBS洗3min,重复3次。加入DAB显色液,室温显色5～10min,镜下控制反应时间,适时终止显色反应。单蒸水冲洗,苏木素复染几秒钟(稀释1:5,过滤),冲洗,切片脱水,透明,中性树胶封片。
光学显微镜下观察鼻组织中p38MAPK阳性表达情况。6个高倍视野光镜下观察照像,然后用JD109图像分析系统进行图像分析,测定阳性细胞数密度和灰度值。
Western blot方法检测磷酸化p38(p-p38)含量,各组分别切取50～100mg黏膜组织,尽量剪碎,按照北京普利莱公司胞浆胞核蛋白提取试剂盒的说明提取核蛋白。经蛋白定量,每条泳道加样15μL行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAGE)分离蛋白质,经电转印将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。牛血清蛋白室温封闭1h。加入稀释度为1:200的兔抗p-p38多克隆抗体,4℃孵育20h。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,稀释度为1:2000,室温下孵育2h,经TBS洗涤,DAB显色,分析各条带磷酸p38(p-p38MAPK)和β-actin的灰度值,并相除来进行标准化,作为p38的相对活化水平。
1.4统计学分析
统计学分析应用SPSS12.0软件分析系统,采用T检验分析组间显著性差异,以P<0.05为具有统计学意义。
2结果
2.1p38MAPK免疫组化染色结果
免疫组织化学染色结果显示,正常鼻黏膜组织中无或少量弱阳性染色;在鼻息肉组中可见大量p38MAPK的阳性染色,阳性染色呈棕黄色颗粒,主要集中在胞浆;在体外实验经布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后,鼻息肉组中仅可见p38MAPK呈弱阳性染色。
2.2p-p38及β-actin凝胶电泳结果(见图1)
为研究p38鼻息肉生成中的作用及机制,我们运用westernblot白印迹法定量技术比较了核p38蛋白(P-P38)在三种组织中的表达水平,结果示P-P38在鼻息肉组及对照组灰度的相对值分别为:0.767士0.77和0.355±0.087。二者相比有显著性差异(P<0.05)(见表1);经布地奈德和克拉霉素及和p38MAPK特异性抑制剂SB203580处理后,P-P38在鼻息肉组灰度的相对值分别为:0.582士0.69。(见图1)
表1 P-P38在鼻息肉和正常组织的表达(P-P38/β-action比值,x±s)
组别例数x±s
鼻息肉组 200.767±0.077
正常组150.355±0.087
图1 P-P38及β-actin凝胶电泳图
(A:为药物干预前,P-P38表达为阳性;B:为药物治疗后,P-P38表达呈弱阳性。)
3讨论
鼻息肉是一种常见病,发病率及复发率均较高,目前治疗最有效的方法为鼻内镜手术加糖皮质激素治疗,但是治疗后仍有20%左右复发,是鼻科目前治疗的难点。鼻息肉的发病机制尚未完全明确。目前认为鼻息肉主要是由多种细胞因子参与的一种持续性炎症反应。细胞因子是由机体的免疫细胞和非免疫细胞所合成和分泌,具有较强的生物活性,广泛存在于鼻息肉的微环境中。p38MAPK信号通路是新近阐明的参与炎症机制的信号通路之一,可能在鼻息肉中起至关重要的介导TNF-α与COX-2的信号传导作用。
p38蛋白是新近发现的与炎症、应激反应密切相关的蛋白激酶,激活后的p38即由胞浆进入到细胞核,表现为其活性形式磷酸化p38(p-p38),它是细胞内主要的信号转导系统[2]。p38MAPK(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)信号传导通路是新近阐明的一条MAPK通路,p38MAPK被激活后,引起下游相应的信号启动并产生广泛的病理生理效应,通过“级联”程序调控细胞因子和应激引起的细胞反应来快速实现信号传递,造成炎症反应“级联放大”[3]。许多研究表明,p38信号传导通路在炎性反应性疾病的发生和发展中具有调控作用。研究发现,在哮喘、慢性阻塞性肺病、变应性鼻炎及慢性鼻-鼻窦炎中,p38MAPK的活化与各种细胞因子、炎性介质的释放有关[4]。Boehme等研究证实,p38MAPK通路能够被促炎因子TNF-ɑ所激活,TNF-α可快速诱导嗜酸性粒细胞中的p38MAPK的磷酸化,并呈时间、剂量依赖关系。鼻息肉的黏膜病理生理学改变与哮喘、变应性鼻炎及慢性鼻-鼻窦炎同属于呼吸道黏膜炎症反应,且密切相关。据此推测,鼻息肉的发病机制中可能也存在经p38M
APK信号传导通路信号的干预和调控。目前相关文献中对p38MAPK信号传导通路在鼻息肉中的作用研究很少。有研究发现,p38MAPK在鼻息肉组织中的黏膜上皮、腺上皮和血管的周围出现异常表达,且核内有磷酸化p38MAPK的表达[2,3]。
本课题研究结果显示,p38MAPK在鼻息肉组织中高表达,而且在复发性鼻息肉组织中表达更显著。表明p38MAPK信号通路参与鼻息肉的发生发展
参考文献
[1] 米淑娜,李志明.鼻息肉相关致病因素研究的新进展[J].医学综述,2007,13(5):365-367.
[2] 亢丽芳,夏立军.p38在慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉中的表达及意义[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2008,22(6):517-519.
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[4] 黄翠萍,张珍祥,徐永健.哮喘大鼠肺组织p38蛋白激酶表达的变化及地塞米松对其影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2003,23(5):334-334.
