摘要：目的探讨氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用机制。方法分离提取慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs),在体外加入氧化苦参碱刺激,检测其诱导抗病毒细胞因子产生的能力,及对Toll样受体9(TLR9)信号通路表达及功能的调节作用。结果氧化苦参碱可直接刺激PBMCs分泌大量干扰素α(IFN-α)和干扰素γ(IFN-γ),上调PBMCs细胞TLR9信号通路中TLR9、髓样分化因子88及肿瘤坏死因子受体相关因子6等信号传递分子,并诱导信号通路活化释放大量抗病毒细胞因子(IFN-α、IFN-γ和肿瘤坏死因子-α)。结论氧化苦参碱通过直接诱导抗病毒细胞因子释放及上调活化TLR9信号通路发挥其抗HBV作用。
关键词：乙型肝炎病毒；Toll样受体信号通路；氧化苦参碱；细胞因子
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.07.009
中图分类号：R259.126.2文献标识码：A文章编号：1005-5304(2014)07-0028-04
Effects of Oxymatrine in vitro on Toll-like Receptor 9 Signal Transduction Pathway in PBMCs from Chronic Hepatitis B PatientsYAO Ning (Clinical Medical College, Gansu University of TCM, Lanzhou 730000, China)
Abstract：Objective To investigate the anti-HBV mechanism of oxymatrine in vitro. Methods The antiviral mechanism of oxymatrine was analyzed through detecting the expression and function of TLR9 signal pathway and the secretion of antiviral cytokines from PBMCs treated by oxymatrine in vitro. Results Oxymatrine could not only induce IFN-α and IFN-γ secretions from PBMCs directly, but also effectively augmented the expressions of TLR9, MyD88 and TRAF6 at mRNA level, and activated the TLR9 signal transduction pathway. TLR9 ligand could induce IFN-α, IFN-γ and TNF-α secretion a lot from PBMCs pretreated by oxymatrine. Conclusion Oxymatrine possesses an anti-HBV activity via activation of TLR9 signal pathway and secretion of antiviral cytokines.
Key words：hepatitis B virus；toll-like receptor signal pathway；oxymatrine；cytokine
乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒,目前全球大约3.5～4.0亿例慢性HBV感染者,慢性HBV感染是引起肝硬化和肝衰竭的主要原因之一[1]。临床有效的抗病毒治疗可以抑制HBV复制,阻止肝脏纤维化进展,减少肝脏功能代偿不全及肝脏原因导致的死亡,降低肝细胞癌的风险[2]。
研究显示,干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NA)可有效抑制病毒复制,缓解肝脏病变。但二者在临床使用中均显示出一定的不良反应,如IFN所引起的流感样症状,NA引起的病毒基因突变而出现的病毒反弹等[3-4]。苦参提取物氧化苦参碱在临床应用、动物实验及细胞实验中均显示出良好的抗HBV活性及抗肝炎效用[5-7],但其相关作用机制尚未明了。
免疫调节是慢性乙型病毒性肝炎(CHB)治疗领域中的研究热点之一。Toll样受体(TLRs)在天然免疫中起着关键作用,并且可以进一步诱导机体产生抗原特异性获得性免疫反应。Toll样受体9(TLR9)是Toll样受体家族中的重要成员之一,主要识别DNA病毒基因组中特殊的非甲基化CpG基因序列,活化的TLR9信号通路能够分泌多种抗病毒细胞因子,抑制病毒复制。
本研究通过体外细胞实验,分析氧化苦参碱对CHB患者外周血单个核细胞(PBMCs)分泌细胞因子及TLR9信号通路的影响,以期进一步阐明氧化苦参碱的抗HBV作用机制。
1资料与方法
1.1一般资料
本研究纳入2013年4－8月甘肃中医学院附属医院门诊CHB患者48例,男29例,女19例；年龄18～41岁,平均(29.3±6.17)岁；体质指数16.3～22.7 kg/m2,平均(20.8±1.96)kg/m2；血清乙肝病毒载量(HBV-DNA)6.18～8.32 log10 IU/mL,平均(7.52±1.37)log10 IU/mL；血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)98～219 IU/mL,平均(163±32)IU/mL；白蛋白40.8～51.7 g/L,平均(46.1±2.83)g/L；总胆红素9.61～16.8 μmol/L,
平均(12.6±1.36)μmol/L；血小板(125～247)×109/L,平均(166±47.1)×109/L。
1.2纳入标准
①乙肝病毒表面抗原(HBsAg)与乙肝病毒e抗原(HBeAg)阳性≥6个月；②血清HBV-DNA＞6 log10 IU/mL；③血清ALT＞80 IU/L；④过去6个月内均未接受IFN-α、NA及其他免疫调节剂治疗；⑤血细胞、空腹血糖及血肌酐检测均在正常范围内。
1.3排除标准
①过去1个月内有发热、过敏现象；②合并甲型、丙型或戊型肝炎病毒感染,酒精性肝炎,脂肪性肝病,肝纤维化,肝硬化,以及肝脏肿瘤患者；③孕妇及哺乳期女性。
1.4氧化苦参碱及Toll样受体9配体
氧化苦参碱由中国江苏正大天晴药业股份有限公司生产(批号130916102),溶于二甲基亚砜冷藏储存,使用终浓度为50.0 μg/mL。TLR9配体CpG ODN 2216由Coley Pharmaceutical Group(Wellesley,MA,USA.)提供,使用终浓度为3 μg/mL[8-10]。
1.5主要试剂
淋巴细胞分离液Ficoll-Paque(Amersham Parmacia Biotech.,批号17-1440-02)；RNA提取试剂TRIzol (Invitrogen Life Technologies,Carlsbad, CA,USA,批号50175111)；反转录及实时定量PCR试剂Takara (Takara Bio.INC.Japan,批号20130918-2)；干扰素α (IFN-α)检测酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂(R&D System,INC.USA,批号130706213)；干扰素γ (IFN-γ)检测ELISA试剂(R&D System,INC.USA,批号 130917155)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测ELISA试剂(R&D System,INC.USA,批号130827015)。
1.6单个核细胞制备
取患者外周静脉全血40 mL,肝素抗凝,密度梯度离心获得人PBMCs,悬浮于1640培养基(含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1.5 mmol/L
L-谷氨酰胺),调整细胞浓度为1×106/mL,台盼蓝染色实验判断细胞存活状态(＞98%)。
1.7RNA提取及实时定量聚合酶链反应
将PBMCs分为2组,一组加入氧化苦参碱刺激,另一组不加刺激剂。48 h后收集细胞,按照TRIzol试剂盒说明书操作指南提取RNA。
取1 μg总RNA,加入随机引物制备cDNA。cDNA采用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)进行扩增分析(Bio-Rad Laboratories,INC.CA.USA.),并采用2-Ct方法进行计算[11]。real-time PCR 25 μL反应体系按照说明书严格执行。real-time PCR反应条件：95 ℃、5 min,随后进行45个循环(95 ℃、15 s, 60 ℃、30 s,72 ℃、30 s)。在每循环的最后一个阶段检测反应体系的荧光强度。待扩增的基因引物及内参见表1。其中,MyD88为髓样分化因子88,TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子6,IRF7为干扰素调节因子7,β-actin为内参基因。
表1待扩增基因引物及内参
基因引物序列(5’端到3’端)
TLR9F：CGGCATCTCAACCTCAAGTGR：CCAGTTTGACGATGCGGTTG
MyD88F：CGGCAACTGGAGACACAAGCR：GGGCAATAGCAGATGAAGGC
TRAF6F：TGGAAGATTGGCAACTTTGGR：GGTAACTGAAGGTGCAAGC
IRF7F：TCCAGGCAGTGCAACAGAGCR：GGAGCCTTGGTTGGGACTG
β-actinF：CCTGGGCATGGAGTCCTGTGR：TCTTCATTGTGCTGGGTGCC
1.8抗病毒细胞因子检测
1.8.1氧化苦参碱诱导细胞因子分泌检测PBMCs分2组培养于24孔板,一组加入氧化苦参碱刺激,另一组不加刺激剂。24 h后收集细胞培养上清液进行检测,采用ELISA分析上清液中IFN-α、IFN-γ及TNF-α的含量。
1.8.2氧化苦参碱诱导活化Toll样受体9信号通路细胞因子分泌检测PBMCs分2组,培养于24孔板,一组加入氧化苦参碱刺激,另一组不加刺激剂。48 h后收集细胞并进行洗涤,再加入细胞培养液培养于24孔板中,同时2组均加入TLR9特异性配体CpG ODN 2216刺激24 h,分别收集细胞培养上清液进行检测,利用ELISA分析上清液IFN-α、IFN-γ及TNF-α含量。
1.9统计学分析
采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以
—x±s表示,采用t检验或Wilcoxon"s rank-sum W检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1氧化苦参碱诱导Toll样受体9信号通路分子基因表达
氧化苦参碱能够诱导免疫清除期CHB患者PBMCs中TLR9、MyD88和TRAF6基因表达,分别增强7.72、3.34、3.95倍,刺激组与非刺激组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；IRF7基因表达未发生明显变化。结果见表2。
表22组PBMCs TLR9信号通路分子mRNA表达比较(—x±s)
组别例数TRL9MyD88TRAF6IRF7
刺激组481.93±0.110.84±0.221.70±0.311.16±0.29
非刺激组480.25±0.060.26±0.030.43±0.071.09±0.18
P值0.0090.0330.0210.167
2.2氧化苦参碱诱导细胞因子分泌
氧化苦参碱诱导免疫清除期CHB患者PBMCs分泌IFN-α和IFN-γ明显增多,2组比较差异有统计学意义(P＝0.032,P＝0.029)；TNF-α分泌2组比较差异无统计学意义(P＝0.319)。结果见表3。
表32组PBMCs细胞因子分泌比较(—x±s,ng/L)
组别例数IFN-αIFN-γTNF-α
刺激组4839.6±9.1736.1±8.1210.9±3.17
非刺激组4821.3±4.2613.8±3.7711.3±4.27
P值0.0320.0290.319
2.3Toll样受体9配体诱导细胞因子分泌
氧化苦参碱处理组细胞培养上清液中抗病毒细胞因子IFN-α、IFN-γ、TNF-α含量明显增高,2组比较差异有统计学意义(P＝0.019,P＝0.036,P＝0.023)。结果见表4。
表42组PBMCs在TLR9配体刺激下细胞因子分泌比较(—x±s,ng/L)
组别例数IFN-αIFN-γTNF-α
刺激组48398.0±23.661.7±12.569.1±19.3
非刺激组48207.0±34.947.4±23.543.9±14.0
P值0.0190.0360.023
3讨论
作为苦参的主要成分之一,氧化苦参碱广泛用于临床治疗CHB,但其作用机制却不十分明确。有文献报道,氧化苦参碱具有抗HBV活性,可以抑制转基因小鼠体内HBV基因表达,降低血清HBsAg与HBeAg含量；可以保护小鼠减轻甚至避免半乳糖胺/脂多糖诱导的爆发性肝炎；可以抑制肝细胞凋亡,临床广泛应用于肝癌治疗[12-14]。氧化苦参碱联合拉米夫定可增强抗HBV作用,并可明显降低拉米夫定耐药及不良反应的产生,并认为氧化苦参碱主要通过抑制机体热休克蛋白70发挥相关效应[5,15]。
机体清除HBV感染有赖于其天然免疫及获得性免疫系统产生的抗病毒细胞因子[16]。IFN除了直接抗病毒应答,还可以调节机体的天然免疫及获得性免疫功能。有研究显示,TLRs介导了重要的病毒感染所诱导的天然免疫及获得性免疫应答。TLR9信号通路主要识别DNA病毒基因组中的特殊基因片段-非甲基化CpG序列,通过MyD88-TRAF6-IRF7通路引起IFN大量释放[17-18]。HBV转基因小鼠在TLR9特异性配体刺激下可诱导分泌出大量抗病毒细胞因子,有效抑制HBV-DNA复制[19]。CpG ODN在体外乙肝疫苗实验中显示其可以诱导产生强烈的Th1型免疫反应[20]。高水平的IFN-α介导机体单核细胞成熟并转化为功能活性的树突状细胞,并刺激杀伤细胞和γδT细胞分泌IFN-γ,形成机体Th1免疫环境[21]。IFN-γ发挥免疫刺激和免疫调节功能,可进一步抑制HBV复制[22]。TNF-α作用双向,既可以引起肝细胞损伤甚至死亡,也可以缩短病毒mRNA半衰期。此外,TNF-α和IFN-γ联合作用可以降解病毒DNA复制中间体[23-24]。
本研究显示,氧化苦参碱在体外既可以直接诱导免疫清除期CHB患者PBMCs释放IFN-α和IFN-γ,产生抗病毒效应,更重要的是诱导PBMCs中TLR9信号通路的表达和活化,通过TLR9识别病毒特异性基因序列,从而释放出大量抗病毒细胞因子,最终起到抗HBV的临床效应。当然,氧化苦参碱抗HBV的作用机制很复杂,中药往往多靶点起效。至于氧化苦参碱是否作用于机体其他免疫通路,还有待进一步深入研究。
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(收稿日期：2013-11-25；编辑：季巍巍)
