摘要：【目的】克隆金鱼热激同源蛋白70（HSC70）和热休克蛋白（HSP40）基因，构建原核表达载体并通过IPTG诱导表达获得目的蛋白，明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能，为揭示金鱼的高温应答机制打下基础。【方法】提取金鱼鳃组织总RNA，利用RT-PCR扩增金鱼HSC70和HSP40基因，将目的基因片段克隆至线性空表达载体pET-32a上构建原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40，转化大肠杆菌Rosetta表达菌株后用IPTG进行诱导表达，并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白。【结果】金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp，编码650个氨基酸；金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp，编码332个氨基酸。金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃和草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%；HSP40氨基酸序列与斑马鱼的完全一致（相似度100.00%），与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%。原核诱导表达获得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达，其大小约91.5和55.0 kD，均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应。【结论】HSC70和HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守，经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达，且携带有Trx标签，能与Anti-Trx抗体发生特异性反应，可作为互作蛋白用于RNA pull down试验。
关键词： 金鱼；HSC70基因；HSP40基因；克隆；原核表达载体
中图分类号： S965.811 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0367-08
0 引言
【研究意义】热激同源蛋白70（HSC70）是70 kD热休克蛋白家族（Hsp70）的成员之一，与细胞分化、发育密切相关，为组成型表达蛋白（Gourdon et al.，2000）。HSC70存在于所有原核及真核生物细胞中，在正常情况下稳定表达，主要参与新生肽链的折叠与组装及蛋白前体转运；在环境胁迫因子（高温、重金属和微生物感染等）的刺激下，其表达量显著上调，而参与内环境稳态的维持，即HSC70是生物体抗逆和抗感染的重要分子（Roberts et al.，2010）。HSP40是广泛存在于细胞内的一种分子伴侣，作为HSC70的辅助伴侣分子，可独自或协助HSC70完成蛋白折叠、解折叠及调节蛋白复合物解聚等，对逆境条件下蛋白或蛋白复合体的稳定维持具有重要作用（王伟等，2012；李雨轩和包勇，2016）。因此，研究HSC70和HSP40两个基因对揭示金鱼耐受高温的生理机制具有重要意义。【前人研究进展】至今，HSC70基因在许多动植物中已被克隆和表达，主要用于研究揭示其对动植物受环境胁迫时的保护机制。张拓（2013）研究表明，大豆蚜（Aphis glycines Matsumura）HSC70基因在25～34 ℃范围内，其表达量随温度升高的变化不明显。徐凯等（2017）研究证实，中华蜜蜂受低温胁迫2 h时的HSC70-4基因表达量最低，但胁迫4 h后的表达量最高，说明HSC70-4蛋白是在中华蜜蜂应对低温胁迫时发挥了生理功能作用。Sathyamoorthi等（2017）研究表明，纹鳢（Channa stria-tus）HSC70基因全长1953 bp，编码650个氨基酸，以在纹鳢鳃中的表达量较高，而在头肾、血液、脾脏和肝脏中的表达量较低。HSP40能使依赖于ATP途径的多肽底物与HSC70有效结合，主要是通过增加ATP水解速率刺激HSC70 ATPase（Minami et al.，1996；Fan et al.，2003）。可见，HSC70在预防蛋白聚集和介导未折叠多肽复性中的伴侣功能在很大程度上取决于其与HSP40的配合度。Matsui等（2007）研究表明，在哺乳动物中HSC70通过分子伴侣HSP40、Hip、CHIP、Bag-4等结合在Bim基因mRNA 3"-UTR富含AU元件的区域，以增强mRNA的稳定性，而Bim蛋白的稳定表达能促进细胞凋亡（Lee et al.，2004）。吴盈盈等（2017）在研究肺炎链球菌HSP40蛋白诱导巨噬细胞免疫应答机制时发现HSP40蛋白可增强NF-κBp65和Akt磷酸化水平，即NF-κB和PI3K-Akt通路参与调控肺炎链球菌HSP40诱导巨噬细胞免疫应答的过程。【本研究切入点】鲤科鱼类的鳃小片间隙细胞在受温度胁迫时会发生凋亡，通过增加鳃的表面积而增强对水体溶解氧的吸收能力（Sollid et al.，2003）。HSC70基因对温度变化敏感，因此研究分析HSC70基因的生物功能对揭示金鱼受温度胁迫时鳃小片间隙细胞的凋亡机制具有重要意义，但目前尚无有关高温胁迫金鱼细胞凋亡分子机制的研究报道。【拟解决的关键问题】采用RT-PCR克隆金鱼的HSC70和HSP40基因，构建原核表达载体并通过IPTG诱导表达获得目的蛋白，明确HSC70和HSP40蛋白的生物学功能，为揭示金鱼的高温应答机制打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验动物
取健康金鱼（20±5 g）用MS-222麻醉后，采集其鳃组织立刻放入液氮低温保存，然后转移至-80 ℃冰箱冻存备用。
1. 2 总RNA提取及cDNA合成
采用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa）提取金鱼鳃组织总RNA，再以PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）逆轉录合成cDNA第一链， -20 ℃保存备用。
1. 3 HSC70和HSP40基因克隆
参考斑马鱼、普通鲤鱼等同源物种的HSC70和HSP40基因编码序列（CDS），利用Primer Primer 5.0设计特异性引物。HSC70-F：5"-GAATTCATGTCCA
AGGGACCAGCT-3"，HSC70-R：5"-CTCGAGTTAGT
CGACCTCCTCGAT-3"；HSP40-F：5"-GAATTCATGG
GAAAAGATTATTAT-3"，HSP40-R：5"-CTCGAGTCA
AGGTGGCAGGATCTGAAC-3"。采用LA-Taq酶体系（TaKaRa）进行PCR扩增，HSC70基因扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，进行34个循环；72 ℃延伸10 min。HSP40基因扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行34个循环；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，用割胶回收试剂盒回收目的片段。目的基因片段与pMD19-T载体在SolutionⅠ连接体系中16 ℃反应3～4 h，分别构建重组质粒pMD19-T-HSC70和pMD19-T-HSP40。
1. 4 融合蛋白原核诱导表达
以EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组质粒pMD19-T-HSC70和pMD19-T-HSP40及空表达载体pET-32a进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳双酶切产物并割胶回收目的条带，用T4连接酶体系连接目的基因与线性空表达载体pET-32a，分别构建原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40。其中，表达载体pET-32a自带Trx-tag和His-tag标签，以便于目的蛋白的检测和纯化。以重组的原核表达载体转化大肠杆菌Rosetta表达菌株，然后将重组菌株置于抗氨苄LB液体培养基中进行扩大培养，至OD600为0.4～0.5时加入IPTG（终浓度0.1 mmol/L），16 ℃过夜诱导表达。采用超声波细胞破碎仪破碎收集到的菌体，分别保存上清液和沉淀悬浮液。用Ni-NTA亲和层析纯化上清液中的目的蛋白，取纯化前后的上清液、沉淀悬浮液按比例加入4×SDS Loading Buffer，并沸水浴10 min使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE分析（12%分离胶，5%浓缩胶）。SDS-PAGE电泳胶块采用考马斯亮蓝染色1 h，脱色液脱色，每隔10 min换一次脱色液，重复4～5次。
1. 5 Western blotting检测
通过Western blotting检测确认纯化蛋白是否为携带Trx-tag标签的融合蛋白。取已纯化的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40上清液，按比例加入4×SDS Loading Buffer，沸水浴10 min使蛋白样品变性，在SDS-PAGE分析的基础上，以硝酸纤维素膜为转移膜、Anti-Trx为一抗、Anti-Mouse IgG为二抗进行Western blotting检测。
2 结果与分析
2. 1 金鱼HSC70和HSP40基因克隆及测序结果
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在2000 bp附近出现金鱼HSC70基因CDS序列的目的条带（图1-A），而1000 bp附近出现金鱼HSP40基因CDS序列的目的条带（图1-B），与预期结果相符。测序结果表明，金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp，编码650个氨基酸（图2）；金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp，编码332个氨基酸（图3）。
2. 2 氨基酸序列生物信息学分析结果
在GenBank中搜索斑马鱼（Zebrafish）、草鱼（Grass carp）、金线鲃（Golden-line barbel）、人类（Humon）和家鼠（House mouse）等的HSC70基因序列并翻译成氨基酸序列，然后导入Clustal Omega中进行氨基酸序列比对分析，结果（图4）表明，金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃、草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%，说明HSC70蛋白在金鱼同源物种及哺乳动物中高度保守。相同方法分析可知，金鱼HSP40氨基酸序列与斑马鱼的相似度达100.00%，即完全一致（图5），与普通鲤鱼（Common carp）、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%，也说明HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守。
2. 3 系统发育进化树分析结果
选取一些具有代表性的鱼类及人类和家鼠的HSC70和HSP40基因CDS序列，利用MEGA 5.0分别构建基于HSC70和HSP40基因CDS序列的系统发育进化树。由图6可看出，在基于HSC70基因CDS序列的系统发育进化树中，金鱼和斑马鱼亲缘关系最近；在基于HSP40基因CDS序列的系统发育进化树中，金鱼和金线鲃、普通鲤鱼、斑马鱼等同属鲤科鱼类的亲缘关系最近。总体上，HSP40基因较HSC70基因更保守。
2. 4 原核表达载体的鉴定结果
构建的原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40经PCR扩增鉴定，发现原核表达载体pET-32a-HSC70大小约7850 bp（图7-A），原核表达载体pET-32a-HSP40大小约6900 bp（图7-B），与预期结果相符。采用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定原核表达载体，均能获得大小约6000 bp的pET-32a载体条带及对应的目的基因条带（图7-C），说明HSC70和HSP40基因CDS序列已成功克隆至pET-32a载体上，构建获得预期的原核表达载体。
2. 5 融合蛋白SDS-PAGE分析结果
原核表达载体pET-32a-HSC70和pET-32a-HSP40转化Rosetta表达菌株经IPTG誘导表达，获得的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40以Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析，结果表明，融合蛋白Trx-HSC70约91.5 kD，融合蛋白Trx-HSP40约55.0 kD，与预期结果相符。融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40均为可溶性表达，纯化后的电泳图杂带较少，目的条带清晰（图8）。
2. 6 融合蛋白Western blotting检测结果
Western blotting检测结果显示，纯化后的融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应，其中，融合蛋白Trx-HSC70在92.0 kD附近出现单一目的条带，而融合蛋白Trx-HSP40在55.0 kD偏下处出现单一目的条带，与预期结果相符，即可确定原核表达获得的融合蛋白是目的蛋白。
3 讨论
HSP70家族高度保守，是迄今为止研究最深入的热激蛋白家族（Mayer and Bukau，2005；Li et al.，2012），能被各种诱导压力源如微生物感染、缺氧条件、渗透胁迫、温度胁迫等诱导表达。在应激状态下，HSP70家族基因表达水平上调，可抑制应激激酶活性，抵制细胞凋亡信号转导中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑制p53介导的细胞凋亡，而对细胞起保护作用（Samali and Cotter，1996）。HSC70是HSP70家族的组成型蛋白成员之一，在正常细胞中均有表达。HSP40属于小分子量热激蛋白家族，在生物个体中分布最广泛，是HSP70家族的辅助分子伴侣（王伟等，2012；李雨轩和包勇，2016）。在哺乳动物中，HSC70蛋白在HSP40分子伴侣的协同作用下，能与Bim基因mRNA 3"-UTR富含AU原件的区域结合，从而促进Bim基因发挥促凋亡作用（Lee et al.，2004）。Schroderus等（2010）研究表明，大鼠通过上调大脑皮层和小脑中的HSC70转录水平以响应热应激。Li等（2012）研究发现，中国软壳海龟在热应激条件下，HSC70转录水平迅速上调，其蛋白相对表达量增加數十倍。此外，热激蛋白家族在Caspase依赖型细胞凋亡调节过程中扮演着十分复杂的角色。一方面，由于热激蛋白对细胞的保护功能，可抑制细胞凋亡；另一方面，热激蛋白作为一种关键的信号蛋白分子伴侣又直接促进细胞凋亡（秦佳等，2007）。
目前，有关HSP70家族的研究主要集中在组织表达差异方面。本研究成功克隆获得金鱼HSC70和HSP40基因，并通过原核诱导表达获得相应的融合蛋白，为后续研究二者对Bim基因稳定性的影响打下了基础。金鱼HSC70基因CDS序列全长1950 bp，编码650个氨基酸；金鱼HSP40基因CDS序列全长996 bp，编码332个氨基酸；二者经原核诱导表达获得的融合蛋白Trx-HSC70、Trx-HSP40约91.5和55.0 kD，且均能与Anti-Trx抗体发生特异性反应。周锦勇等（2009）通过构建原核表达载体HSC70-pRSET-A成功表达出70.0 kD的目的蛋白。周小飞（2011）克隆获得的草鱼HSC70 cDNA序列全长2449 bp，开放阅读框为1953 bp。在遗传进化方面，金鱼HSC70氨基酸序列与斑马鱼、人类、家鼠、金线鲃、草鱼的相似度分别为96.28%、95.50%、95.35%、98.15%和98.61%；而金鱼HSP40氨基酸序列与斑马鱼的氨基酸序列完全一致（相似度100.00%），与普通鲤鱼、金线鲃、人类和家鼠的相似度均为94.12%，说明二者在鱼类及哺乳动物中高度保守。但有关金鱼HSC70是否通过与HSP40协同作用结合在Bim基因上以稳定mRNA，进而促进金鱼特定细胞凋亡以缓解高温症状，尚有待进一步探究。
4 结论
HSC70和HSP40蛋白在鱼类及哺乳动物中高度保守，经原核诱导表达获得的金鱼融合蛋白Trx-HSC70和Trx-HSP40为可溶性表达，且携带有Trx标签，能与Anti-Trx抗体发生特异性反应，可作为互作蛋白用于RNA pull down试验。
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（責任编辑 兰宗宝）
