对照，以质粒DNA为阳性对照同时进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL： ddH2O 14 mL，10×PCR buffer 2.0 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 2.0 μL，10 μmol·L-1 dNTP 1.0 μL，10 μmol·L-1正反引物各2.0 μL，模版DNA 70 ng，5 U·μL-1 Taq聚合酶1.0 μL。PCR循环为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，最后72 ℃充分延伸5 min。取PCR产物10 μL经1%琼脂糖凝胶电泳分离并照相。
2.8 数据处理 采用Excel 2003和Minitab 15进行统计处理。
3 结果与分析
3.1 卡那霉素选择压的确定 将未感染叶柄接种于附加不同浓度卡那霉素的筛选培养基内，检测其对卡那霉素的敏感性（图2）。低浓度的卡那霉素（25 mg·L-1）对叶柄诱导形成试管块茎的抑制不明显；随着浓度的提高，叶柄生长不良，并开始逐步的发白化，再生能力并随之减弱。当卡那霉素质量浓度增至100 mg·L-1时，叶柄分化出试管小块茎的概率仅为0.95%；卡那霉素质量浓度进一步增加时，叶柄全部白化，块茎诱导率为零。尽管高浓度卡那霉素可以完全抑制叶柄分化形成小块茎，但考虑到过高浓度的抗生素可能会迅速杀死植物细胞，不利于转化细胞的存活，因此，采用100 mg·L-1卡那霉素作为有效筛选压。
3.2 乙酰丁香酮（AS）浓度对gus瞬时表达率的影响 vir基因的活化是农杆菌Ti质粒基因整合的前提，常用的vir基因诱导物是酚类化合物乙酰丁香酮（AS）。本试验不加入AS时只有极少的半夏叶柄能够被染成蓝色，加入AS后，半夏叶柄的gus瞬时表达率明显提高（表1）。当AS的质量浓度在40～80 mg·L-1转化效果较好，而且与其他浓度的差异显著，因此本研究AS采用40 mg·L-1。
3.3 菌液侵染时间及浓度对gus瞬时表达率的影响 当菌液侵染半夏叶柄时间达到30 min时，外植体容易因农杆菌毒害缺氧而软腐白化，并且造成后期脱菌困难；而侵染时间为5 min时，gus瞬时表达率均较低（表2）。当菌液浓度的A为0.2时，由于菌液浓度太低而不利农杆菌附着，T-DNA不能有效整合进细胞基因组，大大降低转化效果；而A为1.0时，则浓度过高，叶柄两端切口褐化严重，且在以后的培养中农杆菌不易去除，甚至叶柄全部被农杆菌所包埋污染，从而导致转化效率大大降低。分析表明，A为0.5的菌液浓度，侵染15 min时，半夏叶柄的gus瞬时表达率达到最高，为69.39%。
3.4 预培养时间和共培养时间对转化效率的影响 不经过预培养的半夏叶柄瞬时表达率较高，达到63.30%；随着预培养时间的延长，表达率显著降低（表3）。预培养可以促进细胞分裂，但本实验中延长预培养时间，可能导致外植体进入共培养阶段时细胞的分裂状态已经不利于外源DNA的整合，从而使转化率降低。
农杆菌的附着、T-DNA的转移及整合都在共培养时期内完成，因此农杆菌和外植体的共培养是整个转化过程的重要环节。共培养时间长短直接影响到目的基因整合及得到转化细胞的数量，从而影响转化效率。随着共培养时间增加，瞬时表达率显著提高（表4）。当共培养3 d时达到最高，为58.41%，此时共培养结束后叶柄周围出现肉眼可辨的微菌落，如果继续延长共培养时间，叶柄周围会被农杆菌包裹，后期脱菌较困难，造成叶柄白化死亡，转化率反而会下降。共培养过程中要注意将叶柄平铺于共培养基上，使叶柄与培养基成分充分接触，有利于培养基中的AS作用于农杆菌，促进T-DNA的转移。
3.5 转化植株的获得 在上述优化条件下，即将不经过预培养的半夏叶柄放入含AS 40 mg·L-1农杆菌菌液中（菌液浓度A为0.5），侵染15 min后共培养3 d。将转化后的叶柄接到含有100 mg·L-1 Kan和350 mg·L-1 Carb的分化培养基上进行筛选培养，30 d左右在叶柄的两端分化出抗性的试管小块茎。将抗性小块茎剪下继代培养到到含有100 mg·L-1 Kan选择压的分化培养基内，15 d诱导形成抗性植株（图3）。
3.6 转化植株的PCR检测 从获得的抗性植株试管苗上剪取幼嫩叶片和叶柄组织提取基因组DNA。以sHSP基因的序列设计特异性引物，以未转化植株DNA为阴性对照（-），以pBI121-sHSP为阳性对照（+）进行PCR检测。电泳结果（图4）显示：抗性转化植株扩增出的特异条带虽然比较微弱，但与阳性对照扩增出的特异条带一致，阴性对照则没有扩增出任何条带，表明外源sHSP基因已整合进半夏植株的基因组中。
对215个半夏叶柄进行外源sHSP基因的转化，共得到39株抗性植株。对抗性植株进行gus组织化学染色，仅有6株染色呈阳性。然后对这6株抗性半夏进行PCR检测，全部可以扩增出875 bp的特异性片段（图4），转化率为2.79%。
4 讨论
农杆菌介导的植物外源基因遗传转化受一系列因素的影响，菌液浓度和侵染时间是影响转化效率的重要因素[8]。较低的菌液浓度不利于农杆菌附在外植体上，T-DNA不能有效整合进植物细胞基组组，大大降低转化效果；菌液浓度过高或侵染时间过长，使外植体受到农杆菌过度伤害而导致外植体切口褐化、腐烂严重，且不利于共培养后去除农杆菌，从而大大降低转化效率[9]。因而，在菌液浓度、侵染时间上需严格控制，以避免或减轻对外植体的伤害及农杆菌的污染程度。本试验选择菌液浓度A为0.5，侵染时间为15 min作为适宜的转化条件。同时，加入一定浓度的外源酚类化合物如AS，能够有效的诱导vir基因活化，激活毒性区上其他基因的表达，进一步促进T-DNA的转移，提高转化频率[6]。
卡那霉素能干扰植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡[10]。另外，在遗传转化过程中出现假转化体是不可避免的，只是频率高低不同。本试验中发现大多数转化叶柄在含100 mg·L-1 Kan选择压的培养基上筛选较好，假转化体相对较少，视为最适筛选压。
植物组织在生长发育过程中，活跃的细胞分裂和DNA合成是农杆菌整合的一个必需条件。外植体预培养可以促进细胞分裂，提高转化效率，如预培养对小麦[11]等植物的遗传转化是非常必要的。但是，在北海道黄杨的报道中，预培养则会使转化率降低[12]。本试验研究发现，不经过预培养的半夏叶柄可能在共培养阶段具有细胞最佳的分裂状态，从而有利于农杆菌的附着和T-DNA的转移，瞬时表达率最高。
本研究只进行了抗性植株报告基因的gus组织化学检测和目的基因的PCR检测，然而获得优良的半夏转基因植株还要继续对阳性植株进行检测，包括Northern和Western blotting等分子生物学技术[6]。另外，半夏作为药用植物，今后除了对半夏抗性植株进行抗高温等逆境胁迫试验，必须对半夏的次生代谢产物方面进行综合评价。
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Genetic transformation of Pinellia ternata with
Agrobacterium tumefaciens-mediated sHSP genes
GUO Zhao-yang， CUI Ting-ting， XUE Jian-ping*， ZHU Yan-fang， ZHANG Ai-min， SHENG Wei， TENG Jing-tong
（Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology， School of Life science， Huaibei Normal University， Huaibei 235000， China）
[Abstract] Objective： To establish an efficient genetic transformation system of Pinellia ternata. Method： With petioles from test-tube seedlings of P.ternata as explants， Agrobacterium tumefaciens mediation method was adopted to explore the effect of phenolic substances， A. tumefaciens′s concentration， infection time， pre-incubation time and co-cultivation time on genetic transformation efficiency of P. ternata. Result and Conclusion： The genetic transformation efficiency could be effectively enhanced by infecting in A. tumefaciens culture containing AS 40 mg·L-1 for 15 min for three days. The petioles were put into the differentiation medium containing 150 mg·L-1 Kan and 350 mg·L-1 Carb to screening and cultivation. After around 30 days， microtubers could be observed at both sides of the petioles. Gus staining and PCR verification on the regenerated plants showed that the exogenous gene sHSP had been integrated into genome of P. ternata.
[Key words] Pinellia ternate； genetic transformation； sHSP； Agrobacterium tumefaciens mediation
doi：10.4268/cjcmm20122416
[责任编辑 孔晶晶]
