摘要：目的探讨尼古丁干预人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后，白介素-6（IL-6）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）抗原的表达变化，并分析其相关性。方法将4～6 代HUVECs接种于24孔培养板。随机分为对照组与不同浓度尼古丁组。尼古丁浓度分别为0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10 μmol/L与100 μmol/L。12 h后收集各组细胞上清液。采用酶联免疫吸附双抗体夹心分析法(ELISA)测定各组细胞上清液中IL-6、PAI-1抗原浓度。结果各浓度尼古丁组HUVECs释放IL-6抗原呈浓度依赖性增高，各尼古丁组IL-6含量与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。100 μmol/ L尼古丁组PAI-1含量与对照组比较升高（P<0.05）。HUVECs释放PAI-1与IL-6呈正相关（P<0.05）。结论在体外，尼古丁可诱导HUVECs 释放IL-6、PAI-1增多，参与内皮损伤、炎症与纤溶活性紊乱。
关键词：尼古丁 脐静脉内皮细胞 白介素-6 纤溶酶原激活物抑制物-1
中图分类号：R329.2文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0525-02
血栓性疾病是临床常见病之一，内皮损伤、炎症反应及纤溶系统功能紊乱与该病发生密切相关，内皮细胞损伤是其始动因素。尼古丁作为香烟烟雾的主要有害成分之一，可以活化炎性细胞［1］，引发炎症反应，从而影响内皮细胞功能［2］。在体外，尼古丁可介导内皮细胞释放纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）增多，导致纤溶系统功能紊乱［3］。本文以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为模型，通过不同浓度尼古丁干预HUVECs，探讨内皮细胞PAI-1抗原表达与炎症因子的关系。
1材料与方法
1.1试剂HUVECs细胞株购自上海门谍塔生物科技发展有限公司。实验用尼古丁溶液购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，RPMI -1640培养基、胰蛋白酶购自美国 Gibco公司。 PAI-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，人白介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒购自武汉博士德公司。
1.2HUVECs培养和鉴定HUVECs用含10%FBS的RPMI-1640培养液，在 37 ℃、5%CO2孵箱中培养,隔日换液1次，待细胞生长至亚融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化液以1∶2传代至第4～6 代,接种于24孔培养板上,倒置显微镜下观察可见细胞呈多形“铺路石”样排列。
1.3实验分组待接种于24孔培养板上的第4～6代HUVECs 达90%融合后随机分为对照组与尼古丁组。对照组：培养液中加入与尼古丁相同体积的PBS液，相同实验条件孵育细胞12 h；不同浓度尼古丁组：培养液中分别加入终浓度为0.1 μmol/ L、1.0 μmol/ L、10 μmol/ L与100 μmol/ L的尼古丁，即尼古丁1组、2组、3组与4组。37 ℃、5%CO2与HUVECs孵育12 h。
1.4ELISA测定PAI-1抗原将PAI-1标准品准确复溶，用稀释液做6次倍比稀释,PAI-1标准品浓度分别为120 ng/mL、60 ng/mL、30 ng/mL、15 ng/mL、7.5 ng/mL、3.75 ng/mL及1.875 ng/mL。以A490对PAI-1的标准品浓度在双对数坐标系（PAI-1）上作标准曲线，待测样品PAI-1含量由标准曲线上得出。
1.５ELISA测定IL-6抗原将1 mL样品稀释液加入重组人IL-6冻干标准品内，配制为10000pg/mL。取30μL 10 000 pg/mL的标准品加入有970 μL样品稀释液中，配制为300pg/mL的标准品。余同此类推，分别用稀释液做6次倍比稀释。将所有的标准品和样品的吸光值在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
1.６统计学处理采用SPSS 13.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析SNK-q检验，相关性分析采用Pearson相关分析。
2结果
2.1HUVECs形态观察在倒置相差显微镜下观察HUVECs,可见其形态不规则，呈扁平、椭圆形、梭形或多角形，为单层鹅卵石状镶嵌排列,细胞单层融合时呈典型的“铺路石”样外观。
2.2不同浓度尼古丁对HUVECs释放PAI-1与IL-6的影响HUVECs释放IL-6抗原呈尼古丁浓度依赖性增高趋势，各尼古丁组IL-6含量与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。100 μmol/ L尼丁组PAI-1含量高于对照组（P<0.05）。详见表1。
2.3相关性分析经Pearson相关分析，各组PAI-1与IL-6呈正关（r＝0.712，P<0.05）。
3讨论
内皮细胞损伤可引起炎症因子释放和纤溶系统紊乱［4］，它们之间有着交联作用。而对于吸烟者内皮损伤表现为吸烟后循环内皮细胞死亡增加。在体外，尼古丁可以活化炎性细胞，调控细胞凋亡和增殖，诱导内皮细胞分泌细胞间黏附因子、血管黏附因子、肿瘤坏死因子及白介素-１等细胞因子。本实验通过0.1 μmol/ L、1.0 μmol/ L、10 μmol/ L与100 μmol/ L尼古丁干预HUVECs后，观察到各组上清液中IL-6含量增高，与尼古丁呈浓度依赖性，各组与对照组相比均有统计学意义。IL-6作为体内的一种重要的炎症因子可刺激细胞间黏附分子（ICAM）表达上调［5］，促进白细胞与内皮细胞黏附；诱使化学趋化因子的表达，进一步在病灶区域募集大量炎性细胞，进行局部炎症反应，引起内皮细胞损伤和凋亡。
尼古丁可以损伤内皮细胞引起炎症介质释放，在本试验及相关报道已经得到证实。尼古丁可以引起纤溶紊乱，但确切机制报道较少。PAI-1在纤溶系统中起着决定性作用，PAI-1活性和水平的高低决定着纤溶系统活性的高低程度，是纤溶受损和血栓形成的标志物，主要由内皮细胞及肝细胞合成和释放，内皮细胞合成和释放PAI-1的增加是血栓形成的独立危险因素［6］。PAI-1可以促进中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞趋化运动及上调炎症因子［7］。本实验通过不同浓度的尼古丁干预HUVECs后观察到培养液中IL-6、PAI-1抗原含量明显增加，二者与尼古丁呈浓度依赖性，并且二者呈正相关，可以推测尼古丁损伤HUVECs后，引起IL-6、PAI-1释放，二者通过炎症反应加重损伤内皮细胞，引起IL-6、PAI-1释放增加，这样形成正反馈，最终引起PAI-1含量增加，导致纤溶紊乱。在诱导狒狒DIC模型中，用IL-6预处理后血浆中PAI-1增加20倍。在兔深静脉栓塞模型中可见内皮细胞损伤，PCR检测IL-6 mRNA、PAI-1 mRNA均升高。
IL-6水平的升高与内皮细胞功能紊乱密切相关，是预测血栓性疾病的独立危险因素［8,9］。PAI-1是血栓性疾病的重要标志物，故联合检测IL-6、 PAI的抗原表达可为血栓性疾病的诊断提供理论依据。
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作者简介：薄美玉，女，现为山西医科大学在读硕士研究生，工作于山西省朔州市第一人民医院（邮编：036000）；胡晓芸（通讯作者）、韩葆芬、扈丽娟、杜艳，工作于山西医科大学第一医院（邮编：030001）。
（收稿日期：2011-02-15）
（本文编辑王雅洁）
