![zoޛ)j馔R[4]mO<](https://tp.67gu.com/showimg.php?url=http://img.resource.qikan.cn/qkimages/yycy/yycy201918/yycy20191802-1-l.jpg)
[tӔR[4h5 mNS+- %DR[4+-S+-Q~w)))))vvvvv^߽m5NM8ӯGyZٞrɨ~"kj-x,zYZn)b*x!zj-ڧ*+-jw (r֥qz zYlo! Oi CF&㉩)dp
VvYx5)\v줲b槲)KY۲^)
Sj+ z^h )֥ZZI܇>/w ZZv짍ӭ)7jfz{h|Zf)ǢbVRxz"!m菮ǖ)}4@vrӛ-nw+ayyh}<"'zbjY܇)ڞȭ17ǫצqeܩyr^r"֧q In<ǥ Z蘖qzmrh-jWǫ0zY^rםt^h )֥ZZI܀ayi,}<"اrhƧq.zƧuciǧجjv7}+-t zYl*^ru^rםm/z*'j8^^b%G [&ji^'fޭƧqzYfj DZ*'jw\騶jzȬ{z)zb^u[lNƚȨ+-w(jw ج, ~'r(!zaj{ajاiq+,4<"(Wi N^r0!x '^ǝo+ayZw Yh2V~)z-ؚ,ȚMqaz{kz"vv^('j{bبަ+azX,ȚDqaz{kz"sM9O)ܭyٚj,zjwm籦*'ǫצqez[4qe˜-Mjz >8sM9O.kj-y%G [-j)܅騶jzȬy+r@ u)aw%Ȩ<"(Wi zYl*^r^ǥZ-z',jw\騶jzȬy+rZx)݉ƭx-S+-rvǫj-z{bj[Z~܅騶jzȬzܢZ+yZƧqiݰ*%\jw <")^& rmب&qzYB騶jzȬ^+azXgzw!f+bq O]17(r֥qz ~1>z1?=O^,eazXDD1=uO%Duv]mɷѨky"https://www.shanghai-jy.com/k/duizhao/" target="_blank" class="keylink">对照，且纳入患者均未接受过任何肿瘤相关治疗的初诊患者。本研究已通过武汉大学医学伦理委员会的审批，参与研究者均知情同意并签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 主要仪器、试剂 本研究中的抗体相关信息如下：E-cadherin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，N-cadherin一抗、vimentin一抗、Twist一抗、P-gp一抗、α-tubulin一抗购自美国Santa Cruz Biotechnol公司。Bmi-1一抗、Nanog一抗购自美国Epitomics公司。Alexa Fluor 488/594标记的二抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAPI染液及Lipofectamine 2000购自美国 Invitrogen公司。PrimeScript？誖一步法逆转录试剂盒RT及荧光定量PCR SYBR染液购自日本TAKARA公司。
1.2.2 组织及细胞RNA的提取 患者样本组织置于液氮中保存，提取RNA时，将组织置于将研钵液氮中碾成粉末状，加入Trizol，再以氯仿萃取，随后吸出上层水相，加入异丙醇沉淀RNA，混匀后4℃低温过夜。次日，差速离心并依次以75%、95%乙醇洗涤RNA，随后溶解RNA。细胞的RNA提取为：向细胞培养板中加入Trizol，反复吹打，吸取至EP管，后续操作同组织的酚氯仿法萃取。
1.2.3 cDNA合成 本研究中的cDNA合成，采用日本TAKARA公司的一步法逆转录cDNA合成试剂盒。每次反应体系为：RNA 1 μg，总体积20 μL反应程序为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，降温至4℃。反应完成后，立即将样本置于-80℃冰箱低温保存，直至使用。
1.2.4 荧光定量PCR 本研究中采用TAKARA公司生产的荧光定量PCR mix buffer进行定量扩增反应，反应体系为20 μL，反应程序为：95℃预变性5 min，随后进行39个循环扩增，包括95℃ 1 min，57℃ 30 s，最后5 min溶解曲线。PCR的结果采用GAPDH校正，以校正值为统计值。引物信息见表1。
1.2.5 细胞培养及转染 SW480细胞购自上海中科院细胞典藏中心，培养条件：DMEM basic培养基，10%胎牛血清。孵箱设置为5% CO2，37℃。本研究中的过表达，采用脂质体包裹载体转染。實验前，将细胞种于6孔板中，细胞数量为2×105个，次日将培养基换为无血清培养基，饥饿2 h后，以Lipofectamine 2000试剂包裹2 μg的空载体pcDNA3.1或是pcDNA3.1-Twist载体，转染至SW480细胞。转染6 h后，换为含10%胎牛血清的培养基，孵箱培养48 h后收取细胞。
1.2.6 细胞侵袭检测 细胞检测采用Boyden chambers，预先包被基质胶于小室内。将300 μL体积内的1×105个细胞（培养基胎牛血清浓度为1%）分别转染后种植于小室上层。随后将600 μL胎牛血清浓度为10%的培养基加至小室下的孔板内，作为趋化剂。细胞种植48 h后，终止培养，4%的多聚甲醛固定30 min，随后结晶紫染色，拍照分析。
1.2.7 Western blot分析 细胞以预冷的PBS洗涤后，加入RIPA裂解液裂解并置于冰上超声破碎，再次冰上裂解30 min。12 000 r/min 4℃低温离心15 min后吸取上清，测定浓度后，加入蛋白loading buffer 100℃煮至蛋白变性，至于-80℃冰箱低温保存，直至使用。以Bio-rad公司的蛋白电泳系统检测各组各蛋白表达差异情况，以SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，随后将蛋白转运至聚偏二氟乙烯膜，以5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入一抗工作液过夜（浓度为1∶1000）。次日，室温下复温1 h，随后以TBST洗脱，加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液进行孵育，依次洗涤，曝光，获得图像并分析。
1.2.8 细胞活力测定 细胞活力的测定采用噻唑蓝比色法（MTT）试剂盒，以细胞密度为1×104种植于96孔板中后，分别进行转染，并按浓度梯度加入奥沙利铂（孵育24 h后，PBS洗涤细胞，加入MTT试剂，于570 nm波长处检测各组细胞活力差异情况。
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism Software Version 5.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用One-way ANOVA分析，兩组间比较采用非配对t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 扭曲基因Twist在结直肠癌组织中表达显著高于癌旁组织
为初步探索Twist在结直肠癌中的作用，本研究首先通过荧光定量PCR检测了Twist在结直肠癌组织和癌旁组织中的转录本存在差异情况。结果发现，扭曲基因Twist在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05），见图1。提示在结直肠癌细胞中可能发挥癌基因的作用。
2.2 过表达Twist促使SW480细胞发生EMT形态变化
将Twist在SW480细胞进行过表达后，SW480细胞形态发生了急剧变化，由圆形向长梭形态分化，提示可能发生了EMT能力的变化。细胞侵袭能力检测发现，Twist可显著上调SW480的侵袭能力，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。
2.3 Twist可显著上调EMT分子表达
荧光定量PCR及Western blot检测EMT相关分子表达发现：Twist可显著上调间质相关的N-钙黏蛋白表达，显著抑制上皮相关的E-钙黏蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。
2.4 Twist可促使SW480细胞获得部分干细胞特性
过表达Twist后，调SW480细胞成球能力显著上调，差异有统计学意义（P < 0.05），且干性分子Bmi-1、Nanog、CD44的表达上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。
2.5 Twist可上调SW480细胞化疗药物抵抗的能力
SW480细胞暴露于梯度浓度的奥沙利铂（Oxaliplatin）后，联合进行Twist过表达，随后通过MMT试剂盒检测各组细胞的活力差异情况，结果发现，Twist可保护奥沙利铂对SW480细胞的杀伤。进一步，本研究检测了肿瘤化疗抵抗分子ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ及γ-GT1的表达变化情况，结果提示Twist可显著上调ABCB1的表达，而对其他分子的表达变化并无明显影响。进一步检测发现，Twist可显著上调ABCB1编码的P-gp蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。
3 讨论
结直肠癌是临床常见的肿瘤之一，具有发病率、死亡率高的特点，其发病率位居世界第三，死亡率为世界第四[12-14]。结直肠癌的好发中位年龄为70岁，且随着年纪增长，患病率依次升高[13-14]。既往相关研究取得了长足进展，然而其机制仍然不明确。当前关于结直肠癌的治疗措施主要集中于传统手术切除及放化疗，术后复发及放化疗抵抗等远期不良预后因素依旧较为常见[15]，肿瘤细胞放化疗抵抗是患者不良预后产生的主要原因[16-17]。
肿瘤放化疗打击后的异质细胞产生及肿瘤干性获得的过程中，肿瘤细胞的转录组重编程，众多基因簇表达失衡[18]。本研究发现扭曲基因Twist在癌组织中表达上调，扭曲基因Twist是胚胎发育的关键分子，提示其可能作为癌基因发挥作用，为明确其是否也在放化疗抵抗中发挥作用，本研究首先在结直肠癌SW480细胞系中进行过表达，发现Twist可促使SW480细胞往侵袭表型转换，表现为细胞形态变为梭型，侵袭能力增强，EMT相关标志物急剧变化。研究表明，肿瘤细胞往肿瘤干细胞转变时，其转录组重编程，而EMT相关的转录因子snail、Twist可驱动相关基因表达，促使其干性获得[19-20]。本研究发现Twist在肿瘤组织高表达，同时Twist可促使EMT转变，snail是EMT的关键分子，那么，Twist是否可以促使SW480细胞往干细胞分化，从而获得抗打击能力呢？为此，本研究检测了Twist对SW480细胞成球能力的影响，细胞聚聚成球是干细胞的一大特性，研究发现，Twist可促使SW480细胞成球并可以上调干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44的表达。进一步，本研究对SW480细胞进行了奥沙利铂打击，由结果可知，随着奥沙利铂浓度增加，对照细胞的活性急剧下调，而Twist可保护大部分SW480细胞存活，提示获得干性的SW480细胞对化疗药物的打击失去了敏感性。随后研究发现，该作用是通过ABCB1/P-gp实现的。P-gp是能量依赖性“药泵”调节分子，通过消耗ATP将肿瘤细胞内的化疗药物逆浓度泵至细胞外，降低肿瘤细胞内化疗药物浓度从而产生耐药性[21-22]。
综上所述，Twist可促使结直肠癌SW480细胞发生EMT表型转换，获得干细胞特性，进一步通过ABCB1/P-gp途径，增强其自身耐药。本研究揭示了新的结直肠癌化疗抵抗作用机制，提供了潜在的治疗靶点。
[参考文献]
[1] Christofori G. New signals from the invasive front [J]. Nature，2006，441（7092）：444-450.
[2] Thiery JP，Acloque H，Huang RY，et al. Epithelialmesenchymal transitions in development and disease [J]. Cell，2009， 139（5）：871-890.
[3] Kalluri R， Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition [J]. J Clin Invest，2009，119（6）：1420-1428.
[4] Wu Y， Zhou BP. Snail：More than EMT [J]. Cell Adh Migr，2010，4（2）：199-203.
[5] Campbell K. Contribution of epithelial-mesenchymal transitions to organogenesis and cancer metastasis [J]. Curr Opin Cell Biol，2018，55：30-35.
[6] Diepenbruck M，Christofori G. Epithelial-mesenchymal transition （EMT） and metastasis：yes，no，maybe？ [J]. Curr Opin Cell Biol，2016，43：7-13.
[7] Liu B，Miyake H，Nishikawa M，et al. Expression profile of epithelial-mesenchymal transition markers in non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder：correlation with intravesical recurrence following transurethral resection [J]. Urol Oncol，2015，33（3）：110.
[8] Sui H，Zhu L，Deng W，et al. Epithelial-mesenchymal transition and drug resistance：role，molecular mechanisms，and therapeutic strategies [J]. Oncol Res Treat，2014，37（10）：584-589.
[9] Huang J，Li H，Ren G. Epithelial-mesenchymal transition and drug resistance in breast cancer （Review）[J]. Int J Oncol，2015，47（3）：840-848.
[10] Dong CY，Liu XY，Wang N，et al. Twist-1，a novel regulator of hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid lineage development [J]. Stem Cells，2014，32（12）：3173-3182.
[11] Pirinen E，Soini Y. A survey of zeb1，twist and claudin 1 and 4 expression during placental development and disease [J]. APMIS，2014，122（6）：530-538.
[12] Brenner H，Kloor M，Pox CP. Colorectal cancer [J]. Lancet，2014，383：1490-502.
[13] Siegel R，DeSantis C，Virgo K，et al. Cancer treatment and survivorship statistics [J]. CA Cancer J Clin，2012， 62（4）：220-241.
[14] Center MM，Jemal A，Smith RA，et al. Worldwide variations in colorectal cancer [J]. CA Cancer J Clin，2009，59（6）：366-378.
[15] Roncucci L，Mariani F. Prevention of colorectal cancer：How many tools do we have in our basket？ [J]. Eur J Intern Med，2015，26（10）：752-756.
[16] Goodwin Jinesh G，Willis DL，Kamat AM. Bladder cancer stem cells：biological and therapeutic perspectives[J]. Curr Stem Cell Res Ther，2014，9（2）：89-101.
[17] Islam F，Gopalan V，Wahab R，et al. Cancer stem cells in oesophageal squamous cell carcinoma：Identification，prognostic and treatment perspectives [J]. Crit Rev Oncol Hematol，2015，6（1）：9-19.
[18] Friedmann-Morvinski D，Verma IM. Dedifferentiation and reprogramming：origins of cancer stem cells [J]. EMBO Rep，2014，15（3）：244-253.
[19] Mladinich M，Ruan D，Chan CH. Tackling cancer stem cells via inhibition of EMT transcription factors [J]. Stem Cells Int，2016，2016：5285892.
[20] Nuti SV，Mor G，Li PR，et al. TWIST and ovarian cancer stem cells：implications for chemoresistance and metastasis [J]. Oncotarget，2014，5（17）：7260-7271.
[21] Hano M，Tomá？觢ová L，？譒ere？觢 M，et al. Interplay between P-Glycoprotein Expression and Resistance to Endoplasmic Reticulum Stressors [J]. Molecules，2018，23（2）.pii：E337. doi：10.3390/molecules23020337.
[22] Joshi P，Vishwakarma RA，Bharate SB. Natural alkaloids as P-gp inhibitors for multidrug resistance reversal in cancer [J]. Eur J Med Chem，2017，138：273-292.
