[摘要] 目的 探讨苦参素对溃疡性结肠黏膜细胞中NF-κB mRNA表达的影响机制。 方法 SPF级SD大鼠随机分成正常对照组，UC模型组，UC+苦参素组，UC+柳氮磺胺吡啶组，实验结束时，剖取病灶结肠，RT-PCR方法检测各实验组动物结肠黏膜细胞中NF-κB mRNA表达水平。 结果 苦参素可显著抑制NF-κB mRNA在溃疡性结肠炎症细胞中的表达（P＜0.01）。 结论 苦参素可干预NF-κB mRNA在炎症性结肠黏膜细胞中的表达，进而抑制溃疡性结肠炎症反应。
[关键词] 苦参素；溃疡性结肠炎；NF-κB mRNA；RT-PCR
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）04-29-03
Mechanism of kushenin effecting on the expression of NF-κB mRNA in ulcerative colitis mucosa cells
ZHONG Zhendong1 SU Juan2 HAN Li2
1.Sichuan Academy of Medical Sciences,Sichuan Provincial People"s Hospital Institute of Zoology,Chengdu 610072,China; 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China
[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Kushenin effecting on the expression of NF-κB mRNA in ulcerative colitis mucosa cells. Methods SPF SD rats were randomly divided into normal control group, UC model group,UC + Kushenin group,UC + Sulfasalazine group,At the end of experiment,colonic tissues were dissected,real-time quantitative PCR (RT-PCR) was used to detect the expression levels of NF-κB mRNA in experimental animals colonic mucosa cells. Results Kushenin can significantly inhibit the expression of NF-κB mRNA in ulcerative colitis cells(P＜0.01). Conclusion Kushenin may interfere with NF-κB mRNA in inflammatory colonic mucosa cells,thereby inhibit the inflammatory response of ulcerative colitis.
[Key words] Kushenin;Ulcerative colitis;NF-κB mRNA;RT-PCR
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）为慢性非特异性的肠道炎症性疾病，近年来，国内报道逐渐增多[1]，但其病因、发病机制尚未完全明确[2-4]。一般认为，免疫异常是其发病的主要原因[5-7]。近年研究表明细胞因子、黏附分子及其他炎性递质表达异常与UC免疫病理机制关系密切[8-10]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种具有多向性转录调节作用的核蛋白因子，广泛参与多种基因，特别是免疫炎症反应相关基因的表达调控[11]，在机体炎症反应过程中发挥重要作用。随着免疫学、分子生物学等学科的迅速发展，以及动物模型制作方法的日趋成熟，尤其是近年来对细胞因子、黏附因子、核因子（nuclear factor，NF）κB以及Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）等的研究取得的进展[12-14]，UC的发病机制正逐步得以揭示，并已为或将为新的治疗途径和药物作用靶点提供理论依据。
苦参素是从豆科植物苦参中分离得到的活性成分，近年来国内外对苦参素研究较多，已有研究证实，苦参素具有抗肝炎病毒、抗肿瘤、抗纤维化、抗心律失常等活性，对抗溃疡性结肠炎作用报道较少，在此基础上，本研究采用RT-PCR技术对UC大鼠结肠黏膜细胞NF-κB mRNA表达进行检测，以期对苦参素治疗UC作用机制和靶点进行较深层次探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品 苦参素，四川省农业科学院提供。
1.1.2 引物、试剂、仪器 NF-κB和β-action引物序列见表1。RT-PCR反应试剂盒（大连TaTkRa），三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma公司，批号：107K5008）。紫外分光光度计（美国Beckman公司），PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）。
表1 目标基因和β-action引物
基因名称引物扩增产物
（bp）
NF-κB上游引物5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’
下游引物3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’195
β-action 上游引物5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3’
下游引物5’-CCACAGGATTCCATACCCAAGA-3’208
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及给药 SPF级SD大鼠由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号：SCXK（川）2008-24，平均（200±20）g，适应1周饲养后，按体重随机分成4组，正常组，UC模型组，阳性组（UC+柳氮磺胺吡啶组），苦参素组（UC+苦参素组），每组15只。阳性组动物按600 mg/kg剂量灌胃给予柳氮磺胺吡啶溶液，苦参素组按180 mg/kg剂量灌胃给予苦参素溶液，正常组和模型组灌胃给予等体积生理盐水。
1.2.2 模型复制方法 溃疡性结肠炎症模型参照陈奇先生主编的《中药药效研究思路与方法》——TNBS致大鼠溃疡性结肠炎模型制作。模型成功标准：动物出现血便、黏液稀便等症状。模型复制成功之后，按剂量给药，连续3周。实验结束时，剖取动物结肠。
1.2.3 指标检测
1.2.3.1 结肠黏膜细胞总RNA抽提 采用Trizol一步法抽提各组动物结肠黏膜细胞NF-κB RNA，用紫外分光光度计测定其总RNA的浓度及纯度，筛选OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的样品，计算每份样品的浓度，将全部样品的浓度都配成统一的50 ng/μL。
1.2.3.2 逆转录 按逆转录试剂盒的操作说明进行，将上述抽提的RNA逆转录成cDNA。
1.2.3.3 RT-PCR 选择目的基因NF-κB，作为标准品建立标准曲线，得到样品中相应目的基因的Copy数；同时以管家基因β-actin作为内参建立标准曲线，得到样品中管家基因的Copy数，将目的基因和管家基因的Copy数进行校准，最后得到的Copy数即为目的基因的定量。反应体系为SYBRqPCRmix 12.5μL，引物（2.5 pmol/μL）2μL，去离子水8μL，cDNA（适度稀释）2.5μL，总体系25μL，扩增条件：95 ℃预变性1 min，设计PCR循环程序，95 ℃变性15 s，复性15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。然后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存备用，85 ℃单点荧光检测。
1.3 结果分析
反应结束后，使用Sequence detection soft wareversion1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的CT（threshold cycle）值。CT值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。本研究通过2-△△CT计算SOD相对mRNA表达水平：△CTintervention=CTinterventionNF-κB-CTintervention β-actin；△CTblank=CTblank NF-κB-CT blankβ-actin；△△CT=△CTintervention-△CT blank；NF-κB mRNA表达差别倍数以2-△△CT表示。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。
2 结果
2.1 RT-PCR溶解曲线分析
各实验组NF-κB和ACTION熔解曲线中均有单一的主峰，熔解温度为85℃，相同扩增条件下重复多次，得到的NF-κB和ACTION熔解温度均在85℃左右，上下不超过1 ℃，说明所扩增的为特异性产物。见图1、2。
图1 结肠黏膜细胞中NF-κB荧光定量PCR溶解曲线
图2 结肠黏膜细胞中β-action荧光定量PCR溶解曲线
2.2 2-△△CT法可行性分析
要使2-△△CT法计算方法有效，目的基因与管家基因的扩增效率必须相等。对不同稀释度模板分别进行目的基因和管家基因扩增，得出一条以模板稀释度的对数值为横坐标，以△CT为纵坐标的直线，如果该线的斜率接近于0，说明在反应体系中，目的基因与管家基因的扩增效率接近，也就是说，可以使用2-△△CT法作为相对定量的分析方法。本研究中，浓度梯度线的斜率为0.053 2（Y=0.053 2 logX+1.981），并且目的基因与管家基因扩增曲线平行，说明可使用2-△△CT方法对目的基因进行相对定量。
2.3 NF-κB mRNA表达2-△△CT值
表2显示，NF-κB mRNA在模型组动物结肠黏膜细胞中呈过表达，苦参素治疗组可显著抑制NF-κB在溃疡性结肠黏膜细胞中的过量表达，进而抑制结肠病灶炎症反应，促进溃疡性创面修复。NF-κB mRNA扩增曲线见图3。
表2 各组动物溃疡性结肠炎症黏膜细胞中NF-κB mRNA表达
注：与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01
图3 结肠黏膜细胞中NF-κB mRNA荧光定量扩增曲线
3 讨论
NF-κB是近年发现的转录因子家族中的新成员，是细胞内最重要的核转录因子，他在许多细胞刺激介导的细胞信息的转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志[15]。NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在。在静息细胞中，NF-κB二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白IκB结合而分散在细胞质内[16-18]，包括内质网应激在内的许多因素可激活NF-κB，激活后的NF-κB进入细胞核，与DNA模块上的特异蛋白结合，诱导特异mRNA的产生，最后转录、产生和释放各种细胞因子。
研究证实核转录因子κB（NF-κB）通路在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发生发展中占举足轻重的地位[19]，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1β、IL-6、IL-8等细胞因子已被公认是介导UC发病的促炎因子，且被证实其在转录水平由NF-κB调控[20]。本实验采用RT-PCR技术对实验性大鼠溃疡性结肠炎症细胞中NF-κB mRNA表达进行了检测，结果显示苦参素可显著抑制NF-κB mRNA在炎性细胞中的表达，提示苦参素可介导NF-κB信号通路，进而抑制TNF-α、IL-1β等细胞因子的释放，对抗溃疡性结肠炎症反应，这对于研究苦参素治疗溃疡性结肠炎作用机理及作用靶点有重要意义，为开发靶向性苦参素剂型打下理论基础。
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（收稿日期：2011-11-17）
