材料基础。
关键词：多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;⊿CCK1突变体;互补载体;互补转化子
中图分类号： S435 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）04-0027-03
收稿日期：2014-10-15
基金项目：中西部高校项目（编号：ZXBJH-XK005）;海南大学青年基金（编号：qnjj1212）;海南大学科研启动基金（编号：kyqd1427）。
作者简介：曹申文（1990—），女，硕士研究生，主要从事植物病原真菌分子生物学研究。E-mail：hongshangcsw@qq.com。
通信作者：刘晓妹，博士，副教授，主要从事热带作物病害病原菌致病基因研究。E-mail：lxmpll@126.com。
由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola （Bert.&Curt.）Wei]引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是巴西橡胶树的重要病害之一，现已在世界天然橡胶生产国普遍分布，该病害常造成橡胶树周年反复落叶，植株生长迟缓，枝条回枯或整株死亡，一般胶乳减产20%～45%[1-2]。目前，国内外对该病害的研究在病害诊断、病原菌生物学、病害流行学和防治技术等方面取得了较大进展[3-7]，但在分子生物学研究方面仅报道了4个致病相关基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11]，且大多处于序列特征分析阶段。其中，CCK1是本实验室从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中克隆获得的一个PMK1类促分裂原活化蛋白激酶基因[12]，经前期鉴定，初步确定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌丝形态、产孢、对环境的识别、毒素的产生以及致病性等方面起重要作用，并参与调控高渗胁迫反应[8]。但这些功能仍需通过互补突变体试验来进一步明确，而通过构建其互补载体和转化突变菌株获得互补菌株是关键步骤。本研究以Bar基因为抗性选择标记，用In-Fusion HD Cloning Kit成功构建了⊿CCK1突变体的互补载体p⊿CCKB，并转化了⊿CCK1突变株的原生质体，获得 ⊿CCK1 互补菌株，为明确CCK1基因的功能、揭示巴西橡胶树棒孢霉病菌致病机制打下了材料基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株和质粒：巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌CC004菌株和含Bar基因的质粒pCAMBIA3300，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。CCK1基因突变体 ⊿CCK1 由笔者所在课题组提供。
供试试剂：Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 为BioMiga 公司产品;In-Fusion HD Cloning Kit为Clontech 公司产品;Peasy-T1和大肠感受态大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α为TransGen Biotech公司产品;2×（HS）Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit为TIANGEN公司产品;核酸分子质量标准购自广东省广州东盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料购自北京赛百盛基因技术有限公司;溶壁酶购自广东省微生物研究所;Ampicillin和Basta为Amresco进口分装;其他试剂为国产分析纯;引物合成和测序均由华大基因生物科技有限公司（深圳）完成。 供试引物见表1。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 接种巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CC004菌饼于PD培养液中，28 ℃、150 r/min、黑暗摇床培养4～5 d，收集菌丝，用Fungal gDNA Kit提取基因组DNA。 1.2.2 ⊿CCK1突变体的互补载体构建 先以野生菌株CC004的gDNA和质粒pCAMBIA3300为模板，分别扩增CCK1基因5′端片段C5（包含CCK1基因编码区上游序列和CCK1基因编码区全长序列）、3′端片段C3（CCK1基因终止密码子后的一段序列）及完整的Bar基因，分别克隆于Peasy-T1载体上，选择阳性克隆测序，再以序列完全正确的阳性克隆为模板，分别扩增含同源重组序列的CCK1基因5′端、3′端和Bar片段L-C5、L-C3、L-Bar。纯化扩增产物，再用In-Fusion HD Cloning Kit 将L-Bar基因反向连接于 L-C5 和L-C3之间，连接至pUC19载体上，转化大肠杆菌 DH5α，用pUC19载体通用引物检测克隆，挑阳性克隆测序，筛选插入片段序列没有碱基错配的克隆提取质粒，即完成CCK1基
表1 所用引物信息
序号 扩增片段 引物序列
1 C5：CCK1基因上游 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′
2 C3：CCK1基因下游 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′
3 Bar：除草剂Bar基因 F：5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′;R：5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′
4 L-C5：CCK1基因上游重叠片段 F：5′-CGGTACCCGGGGATCCCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′
5 L-C3：CCK1基因下游重叠片段 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGACTCTAGAGGATCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′
6
L-Bar：除草剂Bar基因重叠片段
F：5′-TCGGCTGTATGACTCTCAAATCTCGGTGACG-3′;R：5′-CTCAGACATGGCACCATGAGCCCAGAACGACGC-3′
7 pUC19载体通用引物 F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;R：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′
8 ⊿CCK1突变体互补片段 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GGTAACAGGCAGGATTAGAT-3′
9 FBB：检测转化子特异性引物 F：5′-TGGTGGAACAATGGCTAATGG-3′;R：5′-GCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′
注：边框部分序列为L-C5或L-C3与pUC19载体重叠序列;划单线部分序列为L-Bar与片段L-C5或L-C3重叠序列。
因互补载体的构建（图1）。
（1）目的片段扩增。构建CCK1基因互补载体所需引物见表1。扩增体系（50 μL）：gDNA或质粒pCAMBIA3300 2 μL、dNTPs（各2.5 mmol/L） 5 μL、上或下游引物 （10 μmol/L）各2 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 1 μL、ddH2O 28 μL。C5/L-C5扩增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，循环35周;72 ℃ 10 min，预期大小约为 1 600 bp。C3/L-C3扩增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环35周;72 ℃ 5 min，预期大小约 100 bp。Bar/L-Bar扩增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环35周;72 ℃ 5 min，预期大小约550 bp。
（2）互补载体p⊿CCK1-C的生成。连接体系20 μL：pUC19 Control Vector Linearized （50 ng/μL） 2.0 μL、Purified products（100～200 ng/μL）2.0 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（5 U/μL）6.0 μL、ddH2O 6.0 μL。上述混合液50 ℃ 孵育15 min后，进行克隆转化大肠杆菌DH5α。并用pUC19载体通用引物检测克隆，预期片段大小约为2 400 bp。送阳性克隆测序，将序列完全正确重组质粒命名为p⊿CCK1-C，即获得了⊿CCK1突变体互补载体。
1.2.3 ⊿CCK1突变体互补转化子的获得和PCR验证
1.2.3.1 ⊿CCK1突变体互补片段的扩增 以L-C5：：Bar：：L-C3基因序列设计引物CCKB-F/R，以p⊿CCK1-C为模板，扩增一段含完整CCK1基因、Bar基因和CCK1基因终止密码子后一段序列的片段。扩增体系同上。扩增条件：95 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，循环35周;72 ℃ 10 min。该片段预期大小2 196 bp。用TIANgel Midi Purification Kit回收该片段。克隆测序正确后，再纯化用作互补片段。
1.2.3.2 互补片段的转化 参照刘晓妹的方法[1]，将回收的片段在PEG介导作用下转化⊿CCK1突变体原生质体，用含 4 mg/mL Basta（对CC004和⊿CCK1菌株的最低抑菌浓度）的PDS培养基进行筛选培养，培养条件为28 ℃黑暗。待有菌落长出后，用无菌牙签蘸取边缘菌丝，接于含4 mg/mL Basta的PDA平板上进行连续5次纯化。
1.2.3.3 互补转化子的PCR验证 用Fungal gDNA Kit提取野生型菌株CC004、⊿CCK1突变体和纯化后的互补转化子基因组DNA。用特异性引物FBB-F/R进行PCR鉴定，预期在野生型菌株CC004中扩增到的条带大小约1 100 bp，在⊿CCK1突变体中扩增不到条带，在互补转化子中能扩增到约 1 600 bp 条带的即为⊿CCK1突变体的互补转化子。将符合预期的互补转化子条带回收并克隆到Peasy-T1上并测序，进一步验证序列的正确性。
2 结果与分析
2.1 巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CC004基因组DNA的提取
从图2可以看出，在15 000 bp以上位置有清晰条带。可见所提取的CC004菌株的DNA比较完整，适合进行下一步试验。
2.2 ⊿CCK1突变体的互补载体构建
2.2.1 目的片段扩增 C5、C3、Bar扩增条带分别在约 1 600、550、100 bp处，符合预期大小（图3）。扩增产物经过克隆测序后，选择序列完全正确的阳性克隆进行下一步试验。
2.2.2 ⊿CCK1突变体互补载体p⊿CCK1-C的生成 以获得序列正确的阳性克隆为模板，用高保真酶扩增回收L-C5、L-C3、L-Bar片段，用In-Fusion HD Cloning Kit 将其连接至pUC19载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑选了12个克隆，用载体通用引物M13-F/R检测，结果表明，在12个克隆中均扩增到了约2 400 bp的片段（图4），符合预期大小。测序结果表明，有3个阳性克隆的序列完全正确，说明 ⊿CCK1 突变体的互补载体p⊿CCK1-C构建成功。
2.3 ⊿CCK1突变体互补转化子的获得和PCR验证
以互补载体质粒p⊿CCK-C为模板，用引物组合CCKB-F/R扩增获得了一段大小约2 200 bp的互补片段（图5）。用该片段转化⊿CCK1突变体原生质体，经过含Basta的平板筛选和纯化后，提取基因组，用特异性引物FBB-F/R扩增验证。结果表明，在野生型CC004基因组中扩增到大小为
1 100 bp的条带，在⊿CCK1突变体中未扩增到条带，在9个互补转化子中扩增到大小约为1 600 bp的条带，送样测序，其中3号样与预期完全相符（图6）。说明⊿CCK1突变体的互补转化子获得成功。
3 结论与讨论
基因敲入是通过同源重组的方法，将基因编码序列用另一基因编码序列进行替换的技术。通过基因敲入，可以让基因在体内表达、研究其功能;也可以将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到验证其基因功能的目的[13]。本研究构建的p⊿CCK1-C基因互补载体属于置换型载体。已有文献报道，在构建基因敲除置换型载体时，目的基因两端的同源序列越大，发生同源重组的概率越高。对于丝状真菌而言，同源序列最好在500 bp以上[14]。且由于线性化质粒相对于环形质粒而言有可能更有利于提高转化率，本试验以互补载体p⊿CCK1-C为模板扩增长片段序列进行原生质体转化。本试验构建的p⊿CCK1-C载体，同源片段为887 bp，置换片段与⊿CCK1突变体也仍有814 bp同源序列，符合置换载体的构建要求。将置换片段PEG介导转化⊿CCK1突变体，成功获得⊿CCK1突变体的互补转化子。
传统的载体构建方法需要载体外对DNA 片段进行繁琐的酶切、连接、亚克隆和鉴定等步骤，费力费时[15]。本试验采用了Clontech公司的In-fusion克隆技术。该技术通过相连片段附加15 bp同源碱基令不同片段进行平末端连接，不附加多余序列，也不受限制性酶切位点的限制，简便、高效。
前期笔者所在课题组已成功获得CCK1基因敲除突变体⊿CCK1，表型测定表明，⊿CCK1完全失去产孢能力菌饼接种时，⊿CCK1突变体致病力丧失，且在菌落和菌丝形态、对环境的识别、毒素的产生等方面也与野生型存在明显的差异[8]。本研究将在后续试验中通过测定互补转化子表型，为进一步明确CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了良好的材料基础。
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